[생화학] 8.1 : DNA 클로닝(cloning) - 1

 

 

이번 포스트부터는 DNA 클로닝(cloning)에 대해 알아보자.

 

 

recombinant DNA는 자연 상태에서는 발견되지 않는, 인위적으로 만들어준 DNA를 의미함. 이걸 만들기 위해서 사용되는 과정이 바로 molecular cloning임. 한편 cloning된 유전자를 다른 개체에 넣어서 그 개체가 recombinant DNA를 가지고 있게끔 하도록 만들어주게 됨. 이를 통해 결과적으로 transgenic animal을 만들거나, GMO food를 만드는 등의 일을 할 수 있음.

 

 

 

 

DNA cloning 방식을 처음으로 고안한 분이 바로 위 그림에 표시되어 있는 Paul Berg이며, 그는 이에 대한 공로로 1980년에 노벨화학상을 받음.

 

 

 

 

Paul Berg는 위와 같은 연구를 함. 보면 viral DNA(SV40)와 γ phage DNA를 섞어서 E. coli에 넣어주는 실험을 함. 이를 위해 DNA에 endonuclease를 처리해 조각을 만들어냄. 이후 exonuclease를 처리해서 trimming을 시켜주게 됨. (이 경우 특별히 5' exonuclease를 처리해줌) 그 다음으로 terminal transferase를 처리해 3' 말단에 AAAA...., 혹은 TTTT.....를 첨가해주게 됨. 이렇게 될 시 AAAA....와 TTTT....가 서로 annealing될 수 있게 될 것임. 그 결과 viral DNA와 γ phage DNA가 서로 합쳐진 채로 E. coli 내로 transformation시킬 수 있게 됨.

 

 

+) 실험을 하다보면 topo vector를 만들어서 쓸 일이 많음. 흔히 PCR의 결과 taq polymerase에 의해 증폭이 일어나면 3' 말단에 A가 붙어있는 경우가 대부분임. 이 때 이 녀석을 vector 내에 recombination하기 위해 양 말단에 T가 sticky로 노출되어 있는 circular vector를 준비하게 됨. 이후 topo라는 isomerase를 처리해주게 되면 이 둘이 합쳐지며 topo vector가 만들어지게 됨. 이러한 전 과정을 TA cloning이라 함.

 

 

 

 

cloning을 한다는 것은 결국 똑같은 정보를 가지고 있는 서열 copy를 만든다는 것을 의미함.

 

 

cloning을 위해서는 PCR을 통해 특정 sequence를 증폭해 만들거나, 혹은 특정 sequence 부분만을 restriction enzyme으로 잘라 준비하는 것이 우선임. 이후 특정 DNA carrier, 즉 vector를 선택한 뒤 vector에 gene을 삽입하게 됨. 이후 recombinant vector를 host cell로 insert하게 됨. 그러면 결과적으로 host가 recombinant DNA에 대한 multiple copy를 만들게 될 것임.

 

 

 

 

위 표에는 cloning을 위해 사용되는 효소들이 나타나 있음. 우선 restriction enzyme은 특정 sequence를 인지해서 자르는 일종의 가위 역할을 함. 그리고 DNA ligase는 잘린 서열을 이어주는 풀의 역할을 함. 그리고 당연히 증폭을 위해서는 host의 polymerase가 필요함. 그리고 cDNA library를 만들고자 할 때라면 RNA→cDNA로 바꿔주는 reverse transcriptase도 필요할 것임. 그 밖에 polynucleotide kinase는 ligation 전단계에서 많이 사용함. 앞서 말했듯 일반적으로 PCR을 위해 사용하는 primer를 만드는 oligonucleotide synthesis 결과물은 5'이 OH로 마감되어 있음. 이 상태로는 아무리 ligation site가 vector와 잘 맞다 해도 ligation이 일어날 수 없음. 따라서 이 부분에 phosphate를 붙여주는 polynucleotide kinase가 ligation 전에 반드시 작용해야 함.

 

 

그 밖에 3' OH에 A, T를 transfer해주는 terminal transferase, 끝부분, 혹은 중간부분을 잘라주는 exonuclease, endonuclease가 cloning시 필요할 수 있음. 마지막으로 alkaline phosphatase도 사용될 수 있는데, 이 녀석의 경우 5'의 phosphate를 잘라버려서 restriction enzyme에 의해 잘린 서열이 바로 다시 self-ligation되는 것을 block해줄때 사용함.

 

 

 

이제 DNA cloning 과정에 대해 조금 더 자세히 알아보자.

 

 

 

 

DNA cloning의 첫 step은 위 그림에 나와있는 것과 같이 recombinant vector를 제작하는 step임.

 

 

보면 일단 전체 DNA를 조각낸 뒤 우리가 관심있게 보고자 하는 붉은색 DNA 부위를 PCR에 이은 gel electrophoresis로 purify함. 이어서 DNA와 vector를 모두 동일한 종류의 restriction enzyme으로 자른 후 ligation을 하게 됨. 그 결과 위 그림 맨 아래와 같은 recombinant vector가 만들어지게 됨.

 

 

이제 이 step에서 사용되는 여러 enzyme들에 대해 더 알아보자. 우선 restriction endonuclease에 대해 알아보자. 이 녀석의 이름을 보면 실제로 DNA의 중간부분을 잘라준다는 것을 알 수 있음. 특히 이 녀석은 specific한 sequence를 인식해서 DNA 내부의 phosphodiester bond를 깨줌. 이런 enzyme들은 보통 bacteria에서 많이 발견되는데, bacteria는 원래 restriction endonuclease를 infectious viral DNA를 제거하는 용도로 많이 사용함.

 

 

 

 

위 그림은 제한효소의 종류에 따라 specific한 site가 잘림을 보여주고 있음. (주로 palindromic sequence를 인식) 이 때 sticky end(staggered end)가 나타날 수도, blunt end가 나타날 수도 있음. sticky end끼리는 sequence가 상보적일 시 specific하게만 ligation될 수 있음. 그러나 blunt end끼리는 sequence가 상보적이지 않아도 non-specific하게 ligation될 수 있음.

 

 

 

 

위 site는 restriction enzyme이 내 서열의 어느 부분을 잘라줄 수 있는지를 확인해줄 수 있는 tool을 제공하므로 참고할 것.

 

 

 

 

사실 restriction enzyme에는 위와 같이 많은 종류가 있음. 그러나 우리가 보통 실험에서 사용하는 녀석은 type II restriction enzyme임. 그 이유는 type II의 경우 딱 recognition하는 site를 자르며, cofactor도 Mg2+ 하나면 됨. 그러나 다른 녀석들의 경우 recognition site가 random하거나 broad한 범위이고(인식 부위로부터 아주 멀리 떨어진 서열을 자르는 경우도 있음) cofactor도 많이 필요함. 그렇기에 주로 type II를 사용하는 것. (물론 이 녀석을 사용하기 위해서는 특정 온도, pH, ion 농도 등을 맞춰줘야 함)

 

 

 

 

위 그림에는 실제로 restriction enzyme의 사용과정이 나타나 있음. 보면 한쪽 부분은 DNA fragment와 vector 둘 다 EcoR1을 이용해 sticky end로 만들어주고, 나머지 부분은 PvulI을 이용해 blunt end로 만들어주게 됨. 그럴 시 결과적으로 DNA ligase에 의해 위 그림 아래와 같이 recombinant DNA가 만들어지게 됨.

 

 

참고로 서로 다른 종류의 restriction enzyme을 사용했음에도 이들에 의해 생성되는 sticky end가 서로 상보적인 경우에는(compatible end) 이 둘을 같이 이용해서 ligation시키는 것이 가능함. 다만 이 결과 만들어지는 product는 이 두 enzyme에 의해 다 잘리는 것이 불가능함. 그렇기에 ligation 산물은 만들면서 만들어진 product는 공격받지 않게 하고자 할 때 이런 system을 사용할 수 있음.

 

 

 

다음 포스트에서 이어서 알아보자.