[생화학] 8.1 : DNA 클로닝(cloning) - 2

 

 

지난 포스트에 이어 이번 포스트에서 DNA cloning에 대해 더 알아보자.

 

 

 

DNA ligase에 대해 알아보자. DNA ligase가 작동하기 위해서는 조효소가 필요함. 이 녀석은 두 개의 DNA fragment 사이를 phosphodiester bond로 연결해서 중합체를 만들어주는 효소임. 이 녀석은 보통은 DNA repair에 쓰임. (참고로 human DNA ligase는 ATP를 조효소로 사용하고 bacterial DNA ligase는 NAD를 조효소로 사용함)

 

 

 

 

실제로는 위 그림과 같이 dsDNA를 연결할 때 ligase가 사용될 수 있으며 nicked DNA/RNA를 연결하는 과정에서도 ligase가 사용될 수 있음.

 

 

위 그림 오른쪽에 나타나 있는 T4 DNA ligase는 typical한 DNA ligase의 일종이며 이 때 이 녀석이 잘 working하기 위해서는 pH를 잘 조절해주고 cofactor들도 알맞게 첨가해 주어야 함.

 

 

 

 

DNA cloning의 두 번째 step은 위와 같이 DNA를 organism에 transformation시키는 과정임. 참고로 이 때 transformation이라는 용어는 bacteria host에 DNA를 넣을 때 사용하는 표현이고 eukaryote host에 넣을 때는 transfection, virus를 이용해 DNA를 넣을 때는 transduction이라는 표현을 사용함.

 

 

보면 실제로 host 내부에 recombinant vector를 넣어주게 될 시 이 host가 분열하는 과정에서 plasmid도 같이 증폭되게 됨. 이후에 plasmid만 prep해주게 되면 결과적으로 recombinant DNA를 대량으로 얻을 수 있음.

 

 

 

 

그렇다면 어떻게 plasmid만을 prep할 수 있을까. 이를 위해서는 일반적으로 plasmid의 circular한 topology를 이용하게 됨. 실제로 plasmid는 circular하므로 매우 compact함. 이들을 분리하기 위해 보통 p1, p2, p3 buffer를 이용하게 되는데, 이 중 p1은 RNase로, p2는 NaOH(RNA가 catalysis되게 해주며 동시에 일반적인 double strand의 chromosomal DNA도 ssDNA로 풀리게끔 함. 게다가 protein도 풀리게끔 해줌) p3는 pH를 감소시켜주는 buffer로 작용함. 이 때 p2에 의해 풀린 ssDNA가 p3에 의한 낮은 pH 환경에 의해 자기 짝을 제대로 못찾게 되는 효과가 있음. 그 결과 우리는 column을 통과시켜 가며 plasmid만을 prep할 수 있게 되는 것임.

 

 

 

 

 

 

한편 우리는 transformation이 제대로 이루어진 녀석들만 골라 배양하고자 함. 이 때 중요한 것이 바로 antibiotic selection임.

 

 

 

대표적으로 사용 가능한 것이 ampicillin system임. ampicillin은 β-lactam ring을 가지고 있으므로 위 그림 왼쪽 아래와 같이 bacteria 세포벽을 구성하는 peptidoglycan들의 cross-linking을 break할 수 있음. 그 결과 bacteria는 osmotic shock이 있는 환경에 있을 시 membrane 형태를 제대로 유지하지 못하고 lysis되게 됨.

 

 

 

 

이를 이용할 시 위와 같이 antibiotic selection을 할 수 있음. 보면 plasmid 내부에 ampR, tetR과 같은 항생제 저항성 유전자를 넣어둠. 이 때 한 예로 ampR gene은 β-lactamase를 encoding하고 있고 이 효소는 β-lactam ring을 분해하는 활성이 있음. 따라서 이 녀석이 host cell 내로 들어가 발현되기만 하면 ampicillin이 분해되어 활성을 잃게 됨.

 

 

실제로 위 그림에서는 흥미롭게도 ampR site 사이에 recombinant DNA가 들어갈 수 있는 site를 배치해둠. 따라서 우리가 원하는 대로 gene이 plasmid에 recombination되고, 그 상태로 host cell에 들어가게 될 시 tetracycline에 대해서는 저항성이 있을 것이고 ampicillin에 대해서는 저항성이 없을 것임.

 

일단 첫 step으로는 위 그림 3에 나타난 것과 같이 tetracycline이 포함된 배지에 bacteria들을 배양해주게 됨. 그럴 시 실제로 host bacteria 중 plasmid가 제대로 transformation된 녀석만 살아남게 될 것임.

 

 

 

 

 

 

이후 위와 같이 이렇게 키운 colony들을 2개의 배지에 position별로 동일한 pattern으로 transfer시켜줌. 이 때 하나의 배지는 control 배지이므로 앞서와 동일한 배지이고 나머지 하나의 배지는 ampicillin+tetracycline에 해당하는 배지임. 그리고 이후 colony가 자라는 양상을 파악했을 때 control 배지에서는 잘 자라지만 ampicillin까지 들어간 배지에서는 못 살아남는 녀석들을 pick할 시 이 녀석들이 우리가 원하는 recombinant plasmid를 가지고 있는 host bacteria가 될 것임.

 

 

다만 이러한 방법은 다소 old fashion함. 그 대신 최근에는 lacZ system을 많이 이용함. 이에 대해 간단히 소개하자면, 일반적으로 lacZ gene이 있는 region에 multi cloning site(MCS)를 넣어줌. 그럴 시 우리가 원하는 gene이 recombination되면 lacZ가 발현되지 않게 됨. 이 때 배지에 X-gal이라는 substrate를 넣어주게 됨. 이 X-gal은 원래 lacZ에 의해 발현되는 β-galactosidase에 의해 분해될 시 blue의 생성물로 변하게 되지만 lacZ가 발현되지 않을 시 X-gal은 그대로 남아 하얀색으로 보임. 따라서 X-gal이 포함된 배지에서 흰색으로 보이는 colony만을 selection할 시 recombinant plasmid를 가지는 host bacteria만을 선별적으로 select할 수 있음.

 

 

 

 

참고로 어떤 유전정보를 bacteria로 집어넣을 때 bacteria의 종류를 잘 살펴봐야 함. 일반적으로는 보통 실험실에서 내려져 오는 bacteria를 쓰게 될 것인데, 그 중 대표적인 것이 위 그림에 나타나 있는 TOP10임. 이 녀석은 내부에 recA1을 가지고 있는데, 이 gene에 의해서는 bacteria간의 불필요한 recombination이 일어나지 않게 되는 효과가 있음. (즉, 이미 이런 식의 장점들을 가지도록 유전자적으로 조작된 bacteria들을 사용하는 것임)

 

 

 

다음 포스트에서 이어서 알아보자.