[생화학] 8.2 : PCR - 1

 

 

이번 포스트부터는 PCR에 대해 알아보자.

 

 

PCR는 linear DNA 중 일부 부위를 amplify하기 위해 사용할 수 있음. 혹은 더 나아가서 완전한 circular plasmid를 amplify하고자 할 때도 사용할 수 있음. 이 PCR은 cloning을 하기 위해 필요한 gene of interest를 증폭하는 과정으로도 많이 사용됨.

 

 

PCR을 위해서는 target DNA, primer(oligonucleotides complementary to target), nucleotide(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), thermostable DNA polymerase를 mix해주어야 함. 이 mix는 다음으로 thermocycler로 들어가게 되며, 우선 95도로 DNA를 melting한 후 Tm보다 조금 더 낮은 온도에 해당하는 50-60도의 온도에서 annealing을 시키게 되며, 이 과정에서 primer가 target에 annealing됨. 이후 약 72도 정도의 온도에서 polymerase가 primer로부터 5'→3' 방향으로 DNA를 추가적으로 extend시킴. 이런 cycle을 계속 반복하면 PCR이 이루어짐.

 

 

 

 

위 그림은 PCR 과정을 나타내주고 있으므로 참고할 것.

 

 

다만 PCR의 효율이 100%가 아니기에 잘못 합성된 녀석이 있을수 있기도 하고, 그 밖에 primer와 product를 구분할 필요가 있으므로 PCR 이후에는 일반적으로 electrophoresis를 통해 DNA를 separation하게 됨. 이 때 DNA는 - charged molecule이므로 anode쪽으로 migrate하게 되고 이 때 electric field하에서의 이동속도 차이에 의해서 DNA가 분리되게 됨. 이를 위해 보통 사용되는 분자 체는 agarose gel임. (agar와 agarose는 다르다는 것에 주의) 이 때 agarose gel을 통한 DNA의 움직임 mobility는 size와 shape에 따라 다른데, 기본적으로 작은 분자일수록, 그리고 compact한 분자일수록 더 빨리 migration되게 됨. 그리고 최종적으로 결과를 눈으로 확인하기 위해 dsDNA 사이에 끼어들어갈 수 있는 ethidium bromide, 혹은 SYBR green, SYBR gold와 같은 DNA-labeling molecule들이 필요함.

 

 

 

 

실제로 같은 길이의 DNA라 하더라도 위 그림과 같이 nicked된 녀석보다는 linear한 녀석이, linear한 녀석보다는 supercoiled된 녀석이 더 빨리 migration됨을 알 수 있음.

 

 

PCR은 다양한 실험에 사용 가능한데, cloning, site-directed mutagenesis, genotyping, NGS(중 cluster amplification) 등에 사용 가능함. 그 밖에 reverse transcriptase PCR(RT-PCR)을 수행할 시 RNA로부터 cDNA를 만들고 이를 증폭할 수 있으며, 더 나아가 quantitative PCR(Q-PCR)을 이용할 시 RNA, DNA의 상대적인 양을 비교하는 것이 가능함. (참고로 DNA, RNA의 절대적인 양을 비교하고자 할 때에는 droplet digital PCR(ddPCR) mechod를 사용해야 함)

 

 

우선 언급이 나온 김에 site-directed mutagenesis에 대해 알아보자.

 

 

 

 

위 그림에 site-directed mutagenesis와 관련된 대략적인 모식도가 나타나 있음. 실제로 site-directed mutagenesis는 다양한 방법을 통해 가능한데, 본 chapter에서는 그 중에서도 PCR을 이용한 방법에 대해 알아보자.

 

 

 

 

위 그림이 대략적인 과정을 나타내주고 있음. 보면 위 그림에도 나타나 있는 것처럼 PCR을 총 3번 수행함. 첫 번째 PCR은 한쪽 끝에 해당하는 primer와, 우리가 mutagenesis를 시켜주고자 하는 위치의, mutagenesis-wanted sequence에 맞게 합성된 primer를 이용해 진행함. 그리고 두 번째 PCR에서는 앞서와 반대쪽에 해당하는 부분 방향의 primer와 mutagenesis-wanted site의 primer를 이용해 진행해줌. 그럴 시 위 그림 가운데에 나타난 것과 같은 두 종류의 product가 생성됨. 이제 이들을 mix해주게 되면 위 그림 가운데와 같이 mutagenesis site 부위가 서로 overlap되게 될 것이고 이 상태에서 PCR을 한번 더 해주게 되면 dsDNA이면서 우리가 원하는 mutagenesis가 일어난 녀석이 만들어짐. 이후 양 끝에 해당하는 primer를 이용해 PCR을 수행 시 이 서열을 증폭할 수 있음. 결과적으로 총 3번동안, 4종류의 primer를 이용해 site-directed mutagenesis를 할 수 있음.

 

 

 

 

한편 이 과정에서 꼭 들어가야 할 것 중 하나가 바로 위 그림에 나타나 있는 DpnI임. DpnI은 methylation-sensitive restriction enzyme이며, 그러다 보니 기존의 host DNA는 methylation되어 있으므로 이 녀석에 의해 분해될 수 있고 새로 만들어진 DNA는 분해될 수 없음(test tube 내에서는 methylation이 일어날 수 없음). 따라서 이 녀석을 사용해줄 시 PCR 결과 만들어진 생성물만 얻어낼 수 있게 됨.

 

 

 

 

참고로 앞서의 그림을 다시 보면, (b)와 같은 과정을 거쳐 circular DNA도 site-directed mutagenesis시키는 것이 가능함. 이 때도 mutagenesis-wanted site에 붙는 primer를 사용해주게 됨.

 

이제 이렇게 in vitro에서 만들어진 site-directed mutagenesis 산물을 다시 삽입하게 되면 우리가 원하는 mutant를 얻을 수 있게 됨.

 

 

 

다음 포스트에서 이어서 알아보자.