[생화학] 8.2 : PCR - 2

 

 

 

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어 PCR에 대해 알아보자.

 

 

우선 qPCR에 대해 알아보자.

 

 

 

 

위 그림은 qPCR과 관련된 모식도를 보여주고 있음.

 

 

 

실제로 qPCR을 하게 되면 위 그림과 같은 결과를 얻을 수 있음. 이 때 signal이 특정한 threshold보다 더 높아지기까지 필요한 cycle의 수를 바탕으로 시작할 때의 nucleotide 양을 quantify할 수 있음. (실제로 cycle마다 대략 2배씩 증폭되므로 cycle을 계속하면 결국에는 threshold에 도달될 수 있음)

 

이를 위해 크게 두 가지 방법을 사용할 수 있음. 우선 1a의 경우 SYBR green과 같은 dye를 사용해서 DNA에 incorporate되는 정도를 측정하고, 결과적으로 DNA 양을 quantify할 수 있음. 1b의 경우 가운데에 TaqMan probe를 달아서 forward primer로부터 쭉 extend되어가는 과정에서 Taq polymerase가 가지고 있는 5'→3' exonuclease activity를 이용해 TaqMan probe의 R이 떨어지고 그 결과 fluorescence가 발생하게 되는 원리를 이용해 DNA양을 quantify할수도 있음.

 

 

 

한편 PCR을 이용하면 DNA fingerprinting을 할 수도 있음.

 

 

 

 

위 그림에 이와 관련된 모식도가 나타나 있음. 특히 진핵생물의 경우 짧은 sequence들이 일렬로 tandem repeat을 가지고 있는데, 이런 locus specific한 repeat motif가 엄마, 아빠에게서 서로 다른 길이로 관찰되기에 이 locus 주변의 primer를 이용해 PCR하고 electrophoresis할 시 위 그림 아래와 같은 특정한 pattern이 나오게 되고 이를 통해 친자검사를 할 수 있음.

 

 

 

 

다음으로 진핵세포의 유전자를 bacteria에서 발현시키는 방식에 대해 알아보자. 실제로 bacteria의 system을 이용해 진핵세포 단백질을 만들어낼 수 있음. 이럴 시 protein 정제, 혹은 protein 정제를 바탕으로 한 crystallization 등을 용이하게 수행할 수 있음. 그런데 이를 위한 삽입 과정에서는 DNA를 cloning하기보다는 exon만 연결된(intron free한) mature mRNA를 cDNA로 바꾼 채로 이 녀석을 cloning해야 함.

 

 

이 때 mRNA를 cDNA로 만들기 위해서는 reverse transcriptase가 필요함. (참고로 우리 cell 내에 있는 대표적인 reverse transcriptase가 바로 telomerase임)

 

 

 

 

위 그림은 cDNA의 합성과정을 나타내주고 있음. 보면 eukaryotic mRNA는 3' 말단에 poly A tail을 가지고 있음. 그렇기에 oligo T를 primer로 사용하고 reverse transcriptase를 넣어줄 시 역전사가 일어나게 됨. 이후 mRNA-DNA hybrid가 형성되고 나면 이 hybrid가 포함된 sample에 alkali condition을 가해주게 됨. 이 때 이 condition은 mRNA에 있어 매우 harsh한 condition이므로 RNA만을 특이적으로 분해시켜줄 수 있음. 이후 특정 primer를 써서 위 그림 오른쪽 아래와 같이 DNA duplex를 만들고 PCR반응을 할 시 cDNA를 증폭할 수 있음.

 

 

 

참고로 일반적으로 primer를 사용할 때 사용 가능한 primer의 종류는 크게 위와 같이 3가지로 나눌 수 있음. 보면 standard oligo dT 이외에도 random hexamer를 사용해 줄 수 있음. 이 경우 any base로 이루어진 6개의 random hexamer를 만들어 넣어주게 될 시 전체 cDNA를 다 cover해주지는 못하지만 그래도 확률적인 원리에 의해 양적인 정보는 유지하며 mRNA를 quantify하는데 사용될 수는 있음. 한편 standard oligo dT를 사용할 경우 mRNA의 quantity를 알 수 있을 뿐 아니라 mRNA 전체를 cDNA로 바꿔서 정보의 손실 없이 정보변환을 할 수 있음.

 

 

 

다음 포스트에서는 형광단백질에 대해 알아보자.