[생화학] 8.4 : 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction, PPI)

 

 

이번 포스트에서는 단백질-단백질 상호작용(protein-protein interaction, PPI)을 보기 위해 사용 가능한 실험법에 대해 알아보자.

 

 

 

 

우선 단백질 간의 interaction을 확인하기 위해 가장 대표적으로 사용할 수 있는 방법은 위 그림에 나타나 있는 immunoprecipication임. 이 때 protein of interest 앞이나 뒤에 특정 epitope tag를 달아줘서 immunoprecipitation을 수행할 수 있게 됨. (사용가능한 대표적인 tag들이 위 그림 오른쪽 표에 나타나 있음.

 

이 때 대다수의 경우 짧은 sequence를 넣어주게 되는데, 그 이유는 긴 sequence를 넣어줄 경우 이 녀석들에 의해 혹시나 secondary function이 나타날 수도 있기 때문임) 일단 위 그림에 나타난 것처럼 짧은 epitope을 달고 있는 단백질이 만들어지고 나면 이 tag에 붙을 수 있는 antibody를 이용해 protein을 enrichment시키게 됨. (보통 antibody가 bead에 달라붙어 있는데, 조금 더 구체적으로 말하자면 bead 표면에 protein A tag을 붙여서 이 녀석에 의해 antibody Fc 부위가 인지되어 immobilize된 상태임. 이 상태에서 cell lysate를 흘려넣어주게 되면 tag가 포함된 protein, 그리고 이 protein과 interaction하고 있는 complex의 다른 구성요소들까지 다 bead에 붙어 분리되게 됨)

 

이후 이렇게 얻어진 pellet을 잘 isolate하면 위 그림 아래와 같이 epitope tag가 붙어있는 protein과 함께, 이 녀석과 binding하고 있는 다른 protein들까지도 분리해낼 수 있음. 다만 이 실험만으로는 특정 단백질이 다른 단백질과 direct하게 interaction하는지 indirect하게 interaction하는지에 대해 알지 못함.

 

 

 

 

 

 

그 밖에 위 그림에 나타나 있는 TAP(tandem affinity purification)-tag method를 사용할 수도 있음. 이 경우 이름에서도 알 수 있듯이 2개의 tag가 protease cleavage site를 사이로 연결되어 있는 형태로 존재하게 됨. 일단 위 그림에서와 같이 가쪽에 노출되어 있는 protein A를 IgG bead를 이용해 분리함. 이 때 특정 단백질과 함께 상호작용 하는 녀석들이 다 같이 분리될 것임. 이후 TEV protease를 처리해주게 되면 두 tag 사이 부분이 잘려나가게 되고 calmodulin-binding peptide라는 tag이 노출되게 됨. 이후 calmodulin bead를 이용하면 다시금 우리가 관심있는 protein을 enrich시킬 수 있음.

 

 

 

 

 

다음으로 위 그림에 묘사되어 있는 yeast-two hybrid method도 사용될 수 있음. 이 경우 yeast 내부에서 in vivo로 실험이 이루어지게 됨. 보면 특정 조건이 될 시 reporter gene이 발현될 수 있게 구성해놓음. 이 때 특정 조건이 중요한데, 위 그림에 나타나 있는 protein X는 bait로, 일종의 미끼임. 이 protein X에는 Gal4p binding site에 결합할 수 있는 DNA binding domain을 달아놓음. 한편 이 상태에서 bait에 결합하는 protein Y(일종의 prey)가 있을 경우, 이 protein Y에 activation domain이 붙어있는 상태이므로(실제로는 모든 후보군 단백질에 activation domain을 붙여놓고 screening을 수행함. 즉, 모든 후보군 단백질들을 library 형태로 만들어놓고 test 수행) protein X와 protein Y가 interaction한다면 그 결과 DNA binding domain과 DNA activating domain이 reporter gene의 promoter에 작용해 RNA polymerase activity가 확 증가하고 reporter gene의 transcription이 일어나게 됨.

 

 

 

 

 

이 때 실제로 reporter gene으로 HIS3, URA3를 사용할 시 histidine, 혹은 uracil이 부족한 media에서 배양할 때 두 단백질이 서로 interaction 할때만 yeast가 살아남게 될 것임. 한편 reporter gene으로 LacZ를 사용하게 될 경우 X-gal이 있는 배지에서 배양 시 두 단백질이 interaction할때만 파란색 colony가 만들어지게 될 것임.

 

 

 

 

다음 포스트에서는 DNA 마이크로어레이(DNA microarray)에 대해 알아보자.