[생화학] 7.10 : DNA 시퀀싱(DNA sequencing) - 2

 

 

이번 포스트부터는 각종 NGS(next generation sequencing) 방법에 대해 알아보자.

 

 

NGS를 이용하면 high-throughput으로 whole genome을 sequencing할 수 있음. 이 방법의 경우 short read임에도 massively parallel sequencing을 수행할 수 있음.

 

 

typical한 NGS의 workflow는 library preparation→cluster generation→sequencing→data analysis의 순서임. 이 중 library preparation에서는 우선 DNA를 조각조각냄. 이후 5', 3'에 우리가 이미 알고 있는 tag를 붙여줌. 그 다음에 cluster generation을 통해서 이들 DNA 조각들을 증폭시켜줌. 이후 sequencing을 수행하고, 얻어진 결과를 바탕으로 data analysis를 하게 됨.

 

 

 

 

 

위 그림의 오른쪽에 나와있는 것은 whole genome shotgun으로, 전체 DNA를 다 조각낸 후 각각을 sequencing해서 computational하게 조합하는 방식임. 위 그림의 맨 왼쪽에 나와있는 것은 BAC chromosome을 mimic해서 긴 sequence를 일단 넣어놓고, 이를 bacteria에서 증폭시킨 후 토막내서 다시 cloning하고, clone 각각을 sequencing하는 방식임. (이 경우 큰 토막을 내고 증폭 후 다시 잘라서 sequencing하게 됨. 그럴 시 보다 더 정확한 결과를 얻을 수 있음)

 

 

 

 

실제로 최근에는 위와 같이 왼쪽의 hierarchical BAC shotgun read와 오른쪽의 whole-genome shotgun read 방식을 mix해서 많이 사용하곤 함.

 

 

이제 본격적으로 NGS의 각 step에 대해 알아보자.

 

첫 번째 step은 앞서 말했던 것처럼 library preparation임.

 

 

 

보면 sequencing을 할 때 어디에서 시작해야할지를 모르기 때문에 우리가 이미 알고 있는 서열인 adapter들을 위와 같이 DNA fragment의 양쪽에 붙이게 됨. (이 때 adapter는 primer가 binding될 자리를 제공해줌)

 

 

두 번째 step은 cluster generation임.

 

 

 

이 step에서는 DNA의 양을 증폭시켜줌. 위 그림을 보면 한 droplet에 토막 하나가 들어갈 수 있게끔 함. 이 때 이 droplet 안에는 PCR이 일어날 때 필요한 요소들이 다 들어있으며, 내부에 있는 bead 표면에 primer들도 다 박혀있는 상태임. 그 결과 위 그림 위쪽 중간에 나온 것처럼 여러 번의 증폭이 일어나게 됨. (이외에도 다양한 방식의 amplification이 가능함) 이후 각 droplet들을 reaction chamber에 넣고 sequencing을 하는 수순으로 protocol이 진행됨. (이 방법은 특히 pyrosequencing method에 해당함)

 

 

 

 

혹은 위와 같은 HiSeq을 거쳐서 solid-phase bridge amplification이 일어나는 방식을 이용하기도 함. 보면 기판에 primer들을 심어놓고, 그 상태에서 adapter를 붙인 library 조각을 뿌리게 됨. 그럴 시 primer와 adapter가 만나 amplification이 일어남. 이 때 amplification 과정이 꽤나 흥미로운데, 보면 200-300개 정도의 nucleotide가 되면 이 녀석이 구부러지게 되고, 끝에 있는 다른 adapter sequence와 기판의 primer 간에 상보적인 결합이 일어남. 이런 과정이 계속되면 하나의 조각이 amplification되어서 같은 sequence를 가지고 있는 fragment가 무수히 많이 만들어지게 됨.

 

 

마지막 step은 sequencing임.

 

 

 

 

위 그림은 각종 sequencing 방법을 보여주고 있음. 이 때 signal detection 방법에 따라 종류가 나누어짐. 이들 각각에 대해서는 자세히 알아둘 필요가 있음.

 

 

보면 dNTP가 새로 첨가되는 과정에서 방출되는 pyrophosphate가 분해되는 과정에서 방출되는 신호를 이용해 sequencing 정보를 detection하는 pyrosequencing, dNTP 첨가 반응에서 나오는 proton을 sensing하여서 sequencing 정보를 detection하는 ion semiconductor sequencing, sanger sequencing과 비슷하지만 reversible terminator를 사용해 sequencing 정보를 detection하는 reversible terminator sequencing이 있음.

 

 

 

다음 포스트에서 이어서 알아보자.