[생화학] 7.9 : DNA 합성(DNA synthesis)

 

 

 

이번 포스트에서는 DNA 합성(DNA synthesis)에 대해 알아보자.

 

 

 

 

DNA 합성을 위해서는 최소한 위와 같은 component들이 필요함. 일단 기본적으로 물, nucleotide, template DNA, primer, enzyme, buffer가 필요하며, 이 buffer는 pH를 조절해주는 역할을 함. 그 밖에 Mg2+와 같은 metal ion들도 들어가야 하는데, 그 이유는 이들이 polymerization 반응에서 상당히 중요하게 사용되기 때문. (사실 이 녀석은 restriction enzyme이 작용할 시에도 중요함)

 

 

 

 

위 그림에는 실제로 DNA가 합성되는 과정이 나타나 있음. 보면 3' OH가 incoming α phosphate를 SN2 attack하게 되고 그 결과 β, γ phosphate가 leaving group이 되면서 떨어져나가게 됨. 그 결과 DNA는 5'→3'으로 합성되게 됨.

 

 

 

위 그림은 nucleophilic attack 과정을 더 자세히 나타내주고 있음. 보면 primer의 3' OH가 새로 들어오는 nucleotide의 α phosphate를 공격하는 것이 나타나 있음. 이 synthesis 과정에서 이들을 잘 allign시켜주는 역할을 하는 것이 바로 enzyme임. (특히 enzyme 내부에 있는 - charge를 띄는 Asp와 같은 녀석이 reaction center로 작용하게 됨) 그 밖에 위 그림을 보면 Mg2+가 나타나 있음. 이들은 중간에 있는 oxygen들, Asp들, 물들을 coordination을 통해서 어느 정도 안정화시켜주는 역할을 하게 됨. (대략 6개씩 coordination을 하게 됨) 조금 더 구체적으로는 Mg2+가 primer end에 있는 O, phosphate와 결합하고 있는 O, 물 분자, DNA pol의 Asp들과 coordination하고 있음. 그 결과 DNA synthesis 과정의 activation barrier가 낮아져서 반응이 일어나게 됨.

 

 

 

 

실제로 PDB data를 보면 위와 같이 metal ion의 coordination이 중요하게 작용하고 있음을 알 수 있음.

 

 

 

이제 이런 기본 원리에 입각하여 우리가 원하는 특정 서열(예를 들어 특정 서열의 primer)을 인위적으로 합성하는 oligonucleotide synthesis를 어떻게 수행할 수 있는지에 대해 알아보자.

 

 

 

 

우선 위 그림과 같이 첫 step으로는 nucleotide들의 3' OH 부분을 silica bead에 붙임. 이 때 우리가 원할 때만 중합반응이 일어날 수 있도록 하기 위해서 DMT라는 blocking group을 사용함. (이 녀석이 5'에 붙어있음)

 

 

 

 

위 그림은 DMT의 구조를 나타내주고 있으므로 참고할 것.

 

 

그 상태에서 두 번째 step으로 DMT를 없애게 됨. 그럴 시 5' OH가 노출되게 됨. 그런 상태에서 앞서 그림에서 나온 것과 같이 phosphoimidite group이 3' OH 위치에 달려있는 새로운 nucleotide를 넣어주게 됨. 그럴 시 이 phosphoimidite가 좋은 leaving group이어서 결국 원래 nucleotide의 5' OH가 이 녀석을 공격해 중합반응이 일어나게 됨. 이후 마지막 step으로 5', 3' 사이에 있는 P를 oxidize해서 phosphodiester bond like한 구조를 만들게 됨. 그 다음에 또 새롭게 첨가된 nucleotide의 5'에 씌워져있는 protection group을 제거해준 후 이 과정을 반복함. 이런 방법을 이용할 시 원하는 서열의 oligo를 제작하는 것이 가능함.

 

 

 

 

위 그림에는 실제로 oligo entry를 입력할 시 앞서의 방법을 이용해 primer를 합성해서 가져다주는 system이 나타나 있으므로 참고할 것.

 

 

 

 

 

위 그림은 앞서 살펴봤던 oligonucleotide synthesis의 과정을 다시금 나타내주고 있으므로 참고할 것. 이 때 몇 가지 유의해서 봐야 할 것이 있는데, 실제로 이 방식에 의해서는 3'→5' 방향으로 DNA 합성이 진행된다는 것임. 그 밖에 이 방법으로 합성된 서열의 경우 5', 3' end가 다 OH임. 따라서 별도로 5', 3' 중 한 곳이 phosphate tagged되어있기를 원한다면 비용을 더 지불하고 option을 추가해야 함. (물론 그냥 이 방법을 통해 합성된 서열이라도 가운데를 restriction enzyme으로 자른다면 이 경우 5' 쪽에는 phosphate가 노출되게 될 것임)

 

 

 

 

한편 이런 합성기작은 수득률이 높을수록 좋을 것임. 그러나 합성되는 서열이 길어지면 길어질수록 내가 원하는 full length의 product는 portion이 점점 낮아질 수 밖에 없음. (5' 방향으로 한개, 혹은 그 이상으로 짧은 서열들이 많이 존재할 것임) 그러므로 정말 긴 서열을 이 방법으로 합성한 경우 합성 이후 gel electrophoresis를 통해 분리 후 우리가 원하는 부분만 slice하거나, hydrophobicity를 이용해 HPLC를 하는 등의 방법으로 별도의 purify를 해야 함.

 

 

 

참고로 위 그림 왼쪽에 나타나 있는 graph는 한번 nucleotide를 합성할 때의 성공확률에 따라서 oligo length 증가에 따른 full length nucleotide의 portion이 어떻게 변하는지를 나타내주고 있음.

 

 

 

 

다음 포스트부터는 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)에 대해 알아보도록 하자.