유세포 분석(flow cytometry)의 원리, 단계, 응용 - 4

 

 

2024.10.27 - [전공자를 위한 생물학/실험] - 유세포 분석(flow cytometry)의 원리, 단계, 응용 - 3

유세포 분석(flow cytometry)의 원리, 단계, 응용 - 3

 

 

 

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어 유세포 분석을 이해하기 위해 필요한 광학적 내용들에 대해 조금 더 알아볼게요.

 

 

 

필터(filter)와 거울(mirror)

 

유세포 분석기에는 빛(포톤)의 경로를 안내하는 다양한 방출 필터(emission filters)와 거울(mirrors)이 있어요. 각 필터 세트는 특정 파장의 빛을 적절한 탐지기(detector)로 안내하는 역할을 해요, 거울은 빛을 탐지기로 유도하는 데 도움을 주죠.

 

 

 

장비의 필터, 거울, 탐지기는 실험에 사용할 형광체(플루오로크롬)에 맞게 수동으로 설정해야 하므로, 실험 설계와 결과 분석 시 장비 설정을 잘 파악하는 것이 중요해요. 혼란을 줄 수 있는 점은, 유세포 분석 전문가들은 관습적으로 이 세 가지 요소(방출 필터, 거울, 실제 탐지기)를 통칭해 “탐지기(detectors)”라고 부르기도 한다는 거예요. 이들은 밀접하게 연동되어 작동하기 때문에 서로 맞춰져야 올바르게 작동할 수 있어요.

 

 

필터의 유형

 

 

롱패스 필터(Longpass filter, LP)
롱패스 필터는 특정 파장 이상의 모든 빛이 통과하도록 해요. 위 그림 A의 예시에서 LP 500 필터는 500nm 이상의 모든 빛이 통과할 수 있도록 해주며, UV와 보라색 파장은 차단하고 파란색, 녹색, 노란색 빛은 통과시켜요.

숏패스 필터(Shortpass filter, SP)
숏패스 필터는 특정 파장 이하의 모든 빛이 통과하도록 해요. 위 그림 B의 예시에서 SP 500 필터는 500nm 이하의 빛만 통과할 수 있게 합니다. 이 필터는 UV, 보라색, 파란색 빛은 통과시키고, 더 높은 파장의 녹색과 노란색 빛은 차단해요.

밴드패스 필터(Bandpass filter, BP)
밴드패스 필터는 롱패스와 숏패스의 중간형으로, 특정 범위 내의 빛만 통과시켜요. 위 그림 C의 예시에서는 525/30 BP 필터가 510–540nm 범위의 빛만 통과하도록 설정되어 있어요. 이는 525nm보다 15nm 낮은 빛과 525nm보다 15nm 높은 빛만 통과하도록 하며, 나머지 빛은 차단되죠.

각 필터는 형광체의 방출 파장에 맞게 탐지기와 함께 적절히 조정되어야 하고, 이를 통해 실험 결과가 정확하게 측정될 수 있어요.

 

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다이크로익 미러 (Dichroic mirror)

 

 

 

다이크로익 미러(또는 다이크로익 빔 스플리터)은 롱패스(LP)와 숏패스(SP) 필터의 한 형태로, 거울 코팅이 되어 있어요. 특정 파장 이상의 빛(LP)이나 특정 파장 이하의 빛(SP)을 투과시키면서, 다른 방향으로 반사도 해요. 예를 들어, 500LP 다이크로익 거울은 500nm 이상의 빛을 투과하고, 500nm이하의 빛은 다른 방향으로 반사해버려요. 마찬가지로, 525SP 다이크로익 거울은 525nm 이하의 빛을 투과하고, 525nm 이상의 빛은 다른 방향으로 반사해요. 이 다이크로익 거울은 빛을 탐지기로 안내하고 수집하는 데 중요한 역할을 해요.

 

탐지기 (detector)

 

탐지기(detectors)는 형광체에서 방출된 포톤과 레이저 산란을 수집하여, 이를 전자 장치로 전달되는 광전류(photocurrent)로 변환해요. 유세포 분석기에서 일반적으로 사용되는 탐지기로는 광다이오드(photodiode, PD)와 광증배관(photomultiplier tube, PMT)가 있어요. 최근에는 원래 광섬유 통신에서 사용되던 아발란체 광다이오드(avalanche photodiode, APD)도 일부 유세포 분석기에서 사용되고 있으며, 특히 장파장(>650 nm) 방출을 감지하는 데 탁월해요. 일부 장비는 CCD 카메라를 탐지기로 사용하지만, 일반적이지 않아 여기서는 다루지 않을게요.

 

 

밝은 신호 측정 - photodiode (PD)

 

포톤이 PD에 도달하면, PD의 원자들을 이온화하여 전자-정공 쌍을 형성해요. (위 그림 A) 이 전자는 양극의 양전위 쪽으로, 정공은 음극의 음전위 쪽으로 이동하면서 광전류를 생성하며, 전자 장치로 전달되는데요. PD는 비용이 저렴하지만 광전류를 증폭하는 능력이 낮아 감도가 낮은 편이에요. PD는 일반적으로 전방 산란 채널과 같이 빛이나 신호가 가장 강한 채널에서 사용되어요.

 

 

어두운 신호 측정 - photomultiplier tubes (PMT)

 

PMT는 낮은 수준의 신호를 감지하는 데 훨씬 민감하며, 단일 포톤의 에너지를 수백만 배로 증폭할 수 있어요. PMT는 일반적으로 세포에서 나온 형광 신호나 측면 산란을 측정하는 데 사용돼요. 포톤이 PMT에 들어가면 광음극(photocathode)을 때려 전자를 생성하며, 이 전자들은 다이노드(dynode) 간 이동하며 이차 전자를 생성해 신호를 증폭시켜요(위 그림 B). PMT의 감도는 PMT 재료와 파장에 따라 다르며, 특히 적외선 영역의 포톤은 에너지가 적어 광전류 출력을 생성하는 비율이 낮죠.

 

 

PMT 감도는 적용된 전압에 따라 조절되며, 실험 설정에 맞게 최적화해야 해요. 가장 일반적인 방법 중 하나는 'Peak 2' 방법이에요(Maecker and Trotter, 2006). 이 방법에서는 희미한 형광 입자를 사용해 다양한 전압 설정(볼트레이션)으로 실험을 진행하고, 신호 분포(변이계수, CV)를 전압에 따라 플로팅했어요. 실험에서 사용할 모든 방출 채널에 대해 이 실험을 실행하는 것이 중요해요.

위 그림에 나타난 예시에서는 형광 입자를 녹색 형광 채널에서 PMT 전압을 200 mV에서 400 mV까지 증가시키며 실험한 결과를 보여주고 있어요. 200 mV에서 신호 분포가 넓고, 전압이 높아질수록 데이터의 변동이 작아져요. 350 mV 이상에서는 CV가 더 이상 차이가 없음을 볼 수 있어요. 최적 전압 설정은 %CV가 가장 낮은 지점이며, 이 예에서는 350 mV가 최적 전압임을 알 수 있죠.

 

 

 

다음 포스트에서는 유체역학(fluidics)적인 관점에서 유세포 분석의 원리에 대해 보다 더 자세히 알아보도록 할게요.