유세포 분석(flow cytometry)의 원리, 단계, 응용 - 3

 

 

지난 두 포스트에서는 유세포 분석의 기본적인 특징, 그리고 작동 방법에 대해 알아봤어요.

 

 

이번 포스트부터는 보다 면밀히 유세포 분석법의 원리에 대해 알아보도록 해요. 이번 포스트에서는 특히 유세포 분석법의 '광학적' 특징들에 대해 면밀히 알아보도록 할게요.

 

 

 

 

유세포 분석은 개별 세포를 레이저 광선으로 조사하고, 이에 따라 발생하는 형광과 산란 데이터를 수집하는 과정에 의존해요. 광학 시스템(optics system)은 유세포 분석기 내에서 세포를 비추고 빛을 수집하는 역할을 담당하죠.

 

 

광학 시스템의 구성 요소들은 서로 협력하여 특정 파장의 빛을 세포에 비추고, 방출된 형광 및 산란 데이터(측면 및 전방 산란, 형광 방출)를 포톤 형태로 수집해 전기 신호(광전류, photocurrent)로 변환해요. 이 광전류는 전자 장치로 전달되어 분석되죠. 광학 시스템에는 광원(excitation light sources), 렌즈(lenses), 필터(filters), 그리고 탐지 장치가 포함되어 있어 빛을 수집하고 장비 내에서 이동시키는 역할을 해요.

 

interrogation point

 

세포가 레이저와 상호작용하는 지점이 조사 지점(interrogation point)으로, 여기서 세포는 단일 파일로 이동하며, 집중된 이 유체 스트림을 통과하게 돼요.

 

유세포 분석기에서 가장 일반적인 광원은 레이저입니다. 레이저 광은 일관성(coherence), 단색성(monochromatic), 높은 에너지라는 특성을 가져 특정 파장의 균일한 빛으로 세포를 비출 수 있도록 해줘요. 일반적으로 유세포 분석기에는 하나 이상의 레이저 라인이 포함되어 있으며, 각 라인은 특정 파장의 빛을 제공해요.

 

 

 

 

위 표에는 일반적으로 가장 많이 사용되는 파장대와, 각각에 대해 사용 가능한 형광체들이 나타나 있어요.

 

 

반응형

 

병렬 및 공선형 레이저 배열

 

 

 

실험에 사용할 형광 물질(플루오로크롬)을 결정할 때 광원의 종류와 구성 방식을 이해하는 것이 매우 중요해요. 유세포 분석기에서 레이저는 크게 병렬 배열(parallel arrangement)과 공선형 배열(co-linear arrangement)로 구성될 수 있어요.

 

 

 

 

병렬 배열 (Parallel arrangement): 병렬 배열에서는 레이저가 공간적으로 분리되어 있어 세포가 조사 지점을 통과하면서 하나의 광원에만 노출돼요.

 

 

공선형 배열 (Co-linear arrangement): 공선형 배열에서는 레이저가 동일한 광학 경로를 공유하므로 세포가 동시에 여러 레이저의 빛에 노출되죠.

 

 

이러한 배열은 상호 배타적이지 않아, 한 장비에서 병렬 배열과 공선형 배열을 모두 가질 수도 있어요. 각 구성 방식에 따라 실험에 사용할 수 있는 형광 물질과 분석 방식이 달라질 수 있기 때문에 유세포 분석기의 레이저 구성 방식을 파악하는 것이 중요해요. 

 

 

형광체 (Fluorophore) 선택

 

 

형광체 선택은 장비의 레이저 배열 방식에 따라 달라질 수 있어요. 실험을 계획하기 전에 장비 설정을 파악하는 것이 중요합니다. 예를 들어, 병렬 레이저 배열(parallel laser arrangement)에서는 레이저가 다른 시간대에 세포를 조사하고, 각 레이저에는 고유한 탐지 장치가 있어요. 이런 경우, 동일한 방출 파장을 가지지만 다른 파장에서 여기되는 두 형광체를 사용할 수 있어요. 예로는 피코에리트린–Alexa Fluor 647 (PE-AF647)과 알로피코시아닌(allophycocyanin, APC) 조합이 있어요. PE-AF647은 488 nm에서 활성화되고, APC는 633nm에서 활성화되지만, 둘 다 680nm 영역에서 방출합니다.

 

 

병렬 배열에서는 488 nm 레이저로 PE-AF647이 먼저 활성화되며, 이 방출광은 해당 레이저 라인에 지정된 탐지기로 수집되어요. 이후 같은 세포에서 APC 염료는 633 nm 레이저에 의해 활성화되고, 방출광은 그 레이저에 지정된 탐지기에 수집되죠. 레이저가 공간적으로 분리되어 있기 때문에 형광 방출의 겹침이 문제가 되지 않아요. 반면, 공선형 레이저 배열(co-linear laser arrangement)에서는 두 레이저(488 nm 및 633 nm)가 동시에, 같은 위치에서 세포를 조사하기 때문에 두 염료의 방출이 겹쳐 구별하기 어려워요.

 

 

병렬 레이저 배열의 시간 지연

 

병렬 레이저 배열에서는 시스템에 시간 지연(time delay)이 내재되어 있어요. 이는 세포가 하나의 레이저에서 다음 레이저로 이동하는 데 걸리는 시간을 나타내며, 각 레이저에서 수집된 신호를 전자 장치 시스템에 함께 전달할 수 있게 해주죠.

 

 

 

대부분의 장비에서는 시간 지연이 자동으로 설정되지만, 필요시 수동으로 모니터링하고 조정할 수 있어요. 시간 지연이 정확하게 설정되지 않으면 신호 손실이나, 심한 경우 다른 세포의 신호가 섞이는 문제가 발생할 수 있습니다. 위 그에서는 시간 지연이 올바르게 설정된 경우와 잘못 설정된 경우의 결과를 보여주고 있어요. (왼쪽 : 올바르게 설정된 경우, 오른쪽 : 잘못 설정된 경우)

 

이 실험에서는 두 형광체가 같은 입자에 동일한 양으로 결합되어 있으며, 하나는 488 nm에서 활성화되어 녹색 형광을 방출하고, 다른 하나는 561 nm에서 활성화되어 빨간 형광을 방출해요. 시간 지연이 적절하게 설정되면 두 신호가 동일한 이벤트 수와 비슷한 패턴을 보이죠. 실제로 왼쪽 그림에서는 이러한 실험 데이터를 볼 수 있어요. 그러나 오른쪽 그림에서는 시간 지연 설정이 30 지점과 50 지점에서 조정되었고, 그 결과로 두 번째 레이저 신호(두 번째 레이저가 조사한 신호)는 첫 번째 레이저 신호보다 낮아지고 이벤트의 분포가 넓어졌어요. 병렬 레이저 배열에서 작업할 때는 이러한 사항을 기억해 두는 것이 중요하죠.

 

 

 

다음 포스트에서는 이번 포스트에 이어서 유세포 분석을 면밀히 이해하기 위해 필요한 광학적 내용들에 대해 다루어보도록 할게요.