유세포 분석(flow cytometry)의 원리, 단계, 응용 - 5

 

이번 포스트에서는 지난 4개의 포스트에 이어서 유체역학적 관점에서 유세포 분석법에 대해 면밀히 알아보도록 해요.

 

 

 

 

유세포 분석기의 유체 시스템은 샘플 튜브에서 흐름 셀(flow cell)로 샘플을 운반하고, 흐름 셀(및 레이저와 탐지기)을 지난 후 샘플을 폐기물로 이동시키는 역할을 해요.

 

 

샘플이 흐름 셀에 들어가기 전에 세포나 입자는 위 그림 A처럼 유체 현탁액 속에서 무작위로 움직이고 있어요. 같은 크기의 세포가 액체의 원통형 기둥에서 이동하는 방식의 분포를 나타내면 쌍곡선 형태가 될 수 있는데(그림 B), 일부 세포는 평소보다 빠르게, 일부는 느리게 이동해요.

 

 

 

또한, 세포들이 일렬로 정렬되지 않고 다양한 위치에 있을 가능성이 높아, 결과적으로 (1) 서로 다른 속도로 이동하는 세포들이 데이터에 변동성을 도입하고, (2) 너무 가까이 있는 세포들이 동시에 분석되어 위 그림과 같 개별적으로 분석되지 않는 중첩 이벤트(coincident events)가 발생할 수 있어요.

 

정확한 데이터 수집을 위해서는 모든 샘플의 입자가 단일 세포로 초점이 맞춰지고 동일한 속도로 움직이도록 해야 해요. 이를 해결하기 위해 유세포 분석기의 유체 시스템은 하이드로다이나믹 포커싱(hydrodynamic focusing)을 사용해요. 즉, 빠르게 흐르는 시스(sheath) 유체(단순한 생리식염수 용액)를 사용해 샘플을 작은 코어 스트림(core stream, 하이드로다이나믹 코어라고도 불림)으로 압축하여, 모든 입자가 동일한 축을 따라 대략 같은 속도로 이동하게 해요.

 

 

이 코어 스트림은 층류 흐름(laminar flow)을 유지하며, 이는 층이 서로 혼합되지 않고 평행하게 이동하는 흐름의 특성인데요. 좁은 코어 스트림으로 초점이 맞춰진 샘플은 조사 지점을 통과하여 폐기물로 이동하거나(분석 장비의 경우) 분류(세포 분류기의 경우)됩니다.

 

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압력 변화의 영향

 

유세포 분석기에서 시스 유체의 압력은 시스템 속도를 결정해요. 이벤트 속도(일정 시간 동안 조사 지점을 통과하는 세포 또는 입자의 수)를 변경하려면 샘플과 시스 유체 사이의 압력 차를 조절해야 해요. 데이터를 빨리 얻기 위해 압력을 높여 이벤트 속도를 높이는 것이 좋아보일 수 있지만, 그로 인해 여러 결과가 발생할 수 있어요.

 

 

 

위 그림 A에서 보여주는 것처럼 낮은 압력 차이는 세포가 한 번에 하나씩 조사 지점을 통과하도록 해요. 하지만 압력을 높이면(그림 B) 코어 스트림이 넓어져 흐름 셀을 더 많은 세포가 동시에 통과할 수 있습니다. 이는 두 개 이상의 세포가 동시에 조사 지점에 위치하는 중첩 이벤트(coincident events)가 발생할 가능성이 높아짐을 의미해요. 이러한 중첩 이벤트는 데이터의 변동성을 증가시키며, 그림 C에서 볼 수 있듯이 이벤트의 수가 증가함에 따라 데이터 분포가 넓어지는 결과를 초래하죠.

 

 

가장 정확한 데이터를 생성하려면 낮은 농도에서 세포를 가능한 천천히 실행하는 것이 좋아요. 느린 속도는 코어 스트림을 유지해 중첩 이벤트와 데이터 분포를 최소화하고 신호의 정밀도를 높여주죠. 이는 희귀 이벤트 분석, DNA 함량 분석, 또는 민감도가 중요한 측정에서 특히 중요해요. 만약 실험의 목표가 단순한 예/아니오 결과를 확인하는 것이라면(예: 형질 도입(transfection) 또는 농축이 잘 되었는지 여부), 중첩 이벤트나 데이터 분포가 큰 영향을 미치지 않기 때문에 장비를 더 빠르게 작동시켜도 괜찮아요. 추가로 여러 샘플 간의 결과를 비교하려면 모든 샘플을 동일한 유속(flow rate)으로 실행해야 해요. 튜브 간에 유속을 변경하면 데이터 분포 차이가 발생해 잘못된 결론을 내릴 수 있겠죠.

 

 

음향 보조 hydrodynamic focusing

 

 

 

 

음향 보조 하이드로다이나믹 포커싱은 높은 압력과 유속에서도 단일 세포 데이터를 안정적으로 수집할 수 있도록 돕는 최신 기술이에요. 이 기술은 유체역학적 힘과 음파를 함께 사용해 세포를 정렬해요. 이를 통해 높은 유속에서도 세포가 좁은 영역 내에 유지되며, 전통적인 유세포 분석기에서 유속 증가와 관련된 데이터 분포를 줄여 데이터의 신뢰도를 높이죠.

 

 

현재 음향 보조 하이드로다이나믹 포커싱을 사용하는 상업용 유세포 분석기로는 Invitrogen의 Attune CytPix와 Attune NxT Flow Cytometer가 있어요. 낮은 유속(10–20 µL/min)에서는 전통적인 유세포 분석기처럼 하이드로다이나믹 포커싱을 사용하여 세포를 정렬하지만, 높은 유속(100–1,000 µL/min)에서는 음파를 사용해 단일 세포 흐름으로 세포를 정렬해요. 이 음향 포커싱 기술은 Attune CytPix 장비의 세포 이미징에서 유용하며, 세포가 정확히 위치해 선명한 이미지를 얻을 수 있게 해줘요.

 

 

차압 시스템과 연동 펌프 시스템

 

 

유세포 분석기의 유체 시스템은 일반적으로 두 가지 설계 중 하나를 따르는데요. 첫 번째는 펌프와 조절기 시스템을 사용해 압력을 생성하는 차압 시스템(differential pressure system)이에요. 차압 시스템에서는 가변 조절기(variable regulator)로 설정된 압력이 샘플 튜브에 적용되어 샘플이 유세포 분석기로 밀려 들어가요. 이 시스템의 경우 볼륨 전달 제어가 절대적이지 않아요. 즉, 동일한 장비 내에서는 샘플 주입량이 일정하지만, 주입된 샘플의 정확한 절대적 볼륨은 알 수 없. 이는 절대 농도를 확인할 필요가 없을 때는 문제가 되지 않지만, 샘플의 정확한 농도를 계산하려면 문제가 될 수 있어요. 농도는 다음 식으로 구할 수 있습니다:

세포 농도=(세포 수/샘플 볼륨​)

 

절대 농도를 얻으려면, 샘플에 미리 정의된 수의 절대 카운팅 비드(counting beads)를 추가해 세포 수를 계산할 수 있어요.

 

 

 

 

두 번째 시스템은 연동 펌프(peristaltic pump)나 주사기 펌프(syringe pump)를 사용하여 샘플을 장비에 전달하는 방식으로, 최신 유세포 분석기에 통합되고 있어요. 위 그에 이 시스템의 예시가 나와 있어요. 이 시스템은 차압 시스템보다 유체 전달을 더 정확하게 제어하므로, 절대적인 세포 수를 신뢰성 있게 측정할 수 있고 이를 통해 샘플 내 특정 세포 유형의 농도를 계산할 수 있어요.

 

 

다음 포스트에서는 유세포 분석기에서 얻은 정보들을 디지털화 하는 과정에 대해 자세히 알아보도록 할게요.