유세포 분석(flow cytometry)의 원리, 단계, 응용 - 6

 

 

이번 포스트에서는 유세포 분석을 통해 얻은 데이터를 디지털화하는 과정에 대해 알아보도록 해요.

 

 

 

 

유세포 분석기의 전자 시스템은 탐지기에서 발생한 광전류(photocurrent)를 디지털화하고 처리해 이후 분석을 위해 저장해요.

 

 

세포가 조사 지점을 통과하며 레이저와 만날 때 방출되는 포톤은 광증배관(PMD) 또는 광다이오드(PD)에 의해 감지돼요. 이 포톤들은 세포에 의해 산란된 빛 또는 세포와 결합한 형광체의 형광 방출로부터 올 수 있어요. 탐지기에 도달한 포톤들은 전자로 변환되고 신호가 비례적으로 증폭돼요. 이 신호는 전기 신호(광전류)로 탐지기를 빠져나가며, 전자 시스템으로 입력되죠. 위 그림서 이 포톤들이 전자 시스템을 통과하는 경로를 단순화한 예시를 볼 수 있어요. 탐지기에서 나온 전기 신호는 증폭기로 이동해 증폭되고 전압 펄스(voltage pulse)로 변환된 후, 아날로그-디지털 변환기(ADC)를 통해 디지털 숫자로 변환돼요. 이 디지털 숫자는 컴퓨터로 전송되어 분석할 데이터가 되죠. 물론 이 과정은 단순화한 것이며, 데이터를 정확히 해석하려면 이 과정에서 알아야 할 중요한 포인트가 몇 가지 있어요.

 

전압 펄스 (voltage pulse)

 

 

 

 

전압 펄스(또는 신호 펄스)는 세포가 조사 지점에 도달해 레이저 경로를 가로지르면서 생성돼요. 방출된 포톤 수는 세포가 레이저를 통과한 후 생성된 형광 빛의 양에 비례하며, 위 그림에서 이 패턴을 확인할 수 있어요. 탐지기에서 포톤이 전자로 변환되기 때문에 이를 전압 펄스라고 부르는 것이죠. 전압 펄스의 크기는 PMT 전압 또는 증폭기 설정에 따라 달라져요. 신호는 PMT에 전압을 가하거나 증폭 게인을 증가시켜 증폭할 수 있어요. 증폭 설정은 선형(Linear) 또는 로그(Logarithmic) 방식으로 구성할 수 있어요. 로그 증폭은 음성 신호와 약한 양성 신호를 분리하는 데 사용되고, 선형 증폭은 산란 및 형광 매개변수를 증폭하는 데 자주 사용되죠.

 

 

 

전압 펄스는 위 그림과 같이 세 가지 요소를 가지고 있어요. 펄스 높이(pulse height)는 수집된 빛의 최대 피크를 나타내고, 펄스 전체 폭(full pulse width)은 펄스 시작부터 끝까지의 시간이에요. 펄스 영역(pulse area)은 높이와 폭(시간)의 적분 값이에요. 이 세 가지 측정값은 각각 세포에 대한 다른 정보를 제공해요.

 

 

 

 

전방 산란 빛(Forward Scatter, FSC)은 레이저 빛이 세포에 부딪힐 때 전방으로 산란되는 빛의 양을 말해요. FSC는 세포 크기에 대략 비례하기 때문에, FSC 전압 펄스의 크기는 세포의 상대적 크기를 반영하죠. 위 그림에 나타나듯이, 작은 세포가 산란하는 전방 방향의 빛은 큰 세포가 산란하는 빛보다 덜 강렬하고, 이에 따른 전압 펄스도 작아요.

측면 산란 빛(Side Scatter, SSC)은 더 큰 각도로 산란되는 빛으로, 세포 내부나 세포 표면의 과립화(granularity)와 구조적 복잡성에서 비롯돼요. 세포가 복잡할수록 산란이 많아져 더 큰 전압 펄스를 생성해요(그림에는 나타나지 않음).

 

 

FSC와 SSC와 마찬가지로, 세포가 레이저 빔을 통과할 때 방출하는 형광은 전압 펄스를 생성해요. 세포와 결합된 형광체(플루오로크롬)에서 방출되는 형광의 양은 두 가지 요인에 따라 달라져요.

 

 

첫 번째 요인은 세포와 결합된 형광체의 수예요. 예를 들어, 세포 표면 단백질의 발현이 낮다면 표면에 결합된 형광 항체가 적어 형광 신호가 약할 수 있습니다. 반대로, 세포가 죽은 경우 특정 염색이 높은 농도로 결합될 수 있고, 이로 인해 형광 신호가 강해져요. 위 그에는 동일한 형광체 레이블을 서로 다른 수로 가진 세포 세 개의 전압 펄스 예시가 나타나 있어요.

 

두 번째 요인은 형광체의 밝기(brightness)입니다. 모든 형광체가 동일한 형광 강도를 제공하지는 않아요. 예를 들어, 붉은 해조류에서 유래한 큰 단백질인 피코에리트린(PE)은 매우 밝은 형광을 나타내며, 반면에 작은 유기 고리 구조를 가진 형광체인 플루오레세인(fluorescein)은 PE보다 훨씬 덜 밝아요. 형광체의 구조와 성질에 따라 방출되는 형광의 강도가 달라지죠.

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비닝 (binning)

 

 

 

위에서 설명한 것처럼 전압 펄스가 생성된 후에는 증폭과 디지털화 과정을 거치게 돼요. 이 과정의 순서는 사용하는 유세포 분석기 모델에 따라 다를 수 있지만, 최종 결과는 동일해요. 증폭과 디지털화 후 전압 펄스 데이터는 빈(binning) 이라는 과정을 거쳐요. 이 과정에서, 각 세포의 전압 펄스 데이터(높이, 전체 펄스 폭, 영역)는 값에 따라 특정 빈에 할당됩니다(위 그림 참). 해당 세포의 각 매개변수(FSC, SSC, 각 채널의 형광 등)마다 전압 펄스가 있고, 각각 해당 매개변수에 맞는 빈에 할당돼요.

 

 

 

모든 세포의 데이터가 수집되고 빈에 할당되면서 데이터 분포가 점점 위 그림과 같이 인구 분포 곡선이나 히스토그램 형태를 띠게 돼요. 빈의 수는 ADC(아날로그-디지털 변환기)의 샘플링 속도와 해상도에 따라 달라져요.

 

 

장비의 전자 시스템을 통해 데이터는 디지털화되고(아날로그에서 디지털로 변환됨), 세포 샘플 분석의 최종 결과물은 표준 유세포 분석 형식의 FSC 디지털 데이터 파일로 저장돼 분석할 준비가 완료되죠. 

이상으로 유세포 분석을 이해하기 위해 필요한 기초적인 내용들에 대해 알아봤어요. 추가적으로 궁금한 점 혹은 디테일한 점들을 질문해주시면 그와 관련된 포스트를 제작해보도록 할게요. 즐거운 실험하세요!