ELISA의 원리, 단계 응용 - 1

 

 

이번 시리즈에서는 단백질의 양을 정량하기 위해 많이 사용되는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)의 원리, 단계, 응용에 대해 알아보도록 해요.

 

 

ELISA(효소 결합 면역 흡착 분석법)는 주로 펩타이드, 단백질, 항체, 호르몬과 같은 용해성 물질을 검출하고 정량화하기 위해 설계된 실험 기법이에요. 효소 면역 분석법(Enzyme Immunoassay, EIA)이라고도 불리는 이 기술은 특정 단백질을 복잡한 혼합물 속에서 탐지하고 정량화하는 강력한 방법이에요. ELISA의 핵심 요소는 항원-항체 간의 높은 특이성을 가진 결합이에요.

 

ELISA는 일반적으로 96-웰 또는 384-웰의 폴리스티렌 플레이트에서 수행되며, 항원(타겟 고분자)은 플레이트 표면에 고정되고 특정 항원과 결합하는 항체에 효소를 부착하여 표적 물질을 탐지해요. 실험 과정에서, 항원과 결합된 항체가 신호를 발생시키고, 신호는 적절한 기질과 반응하여 측정 가능한 산물을 생성함으로써 검출돼요. ELISA 실험의 각 반응물이 미세플레이트 표면에 고정되기 때문에 실험 설계와 수행이 쉬워요. ELISA에서는 고친화성 항체를 사용해 비특이적 결합 물질을 씻어낼 수 있어, 조제물이 복잡해도 특정 분석 물질을 정확히 측정할 수 있는 강력한 도구에요.

 

 

ELISA의 기본 요소

 

다양한 ELISA 변형이 있지만, 모든 종류의 ELISA는 다음과 같은 기본 단계에 의존해요.

코팅/포획 (Coating/Capture) — 항원을 폴리스티렌 미세플레이트 웰 표면에 직접 또는 간접적으로 고정
플레이트 차단 (Plate Blocking) — 불포화 표면 결합 부위를 덮기 위해 비관련 단백질이나 다른 분자를 추가하여 비특이적 결합을 줄임
프로빙/탐지 (Probing/Detection) — 항원과 친화적으로 결합하는 항원-특이적 항체로 항원을 탐지
신호 측정 (Signal Measurement) — 특정 항체에 부착된 태그를 통해 생성된 신호를 검출

 

ELISA에서 주로 사용하는 효소는 서양고추냉이 과산화효소(HRP)와 알칼리성 인산화효소(AP)이며, β-갈락토시다아제, 아세틸콜린에스터라제, 카탈라아제 등의 효소도 사용될 수 있어요. HRP 또는 AP에 결합된 기질은 다양한 감도와 검출 장비(분광 광도계, 형광계, 발광계)에 따라 선택할 수 있으며, 기질 선택에 따라 실험 민감도가 달라져요.

 

 

 

ELISA의 종류

 

 

 

 

ELISA에는 여러 형식이 있으며, 크게 직접(direct), 간접(indirect), 또는 샌드위치(sandwich) 포획 및 검출 방법으로 나뉘어요.. 핵심 단계는 관심 항원의 고정으로, 이는 분석 플레이트에 항원을 직접 흡착시키거나 플레이트에 부착된 포획 항체를 통해 간접적으로 고정해 이루어져요. 항원은 직접적으로(표지된 1차 항체) 또는 간접적으로(표지된 2차 항체 사용) 검출되는데요. 가장 널리 사용되는 형식은 샌드위치 ELISA로, 항원을 간접적으로 고정하고 간접적으로 검출해요. 샌드위치 ELISA는 분석 물질을 두 개의 1차 항체(각각 항원의 다른 에피토프를 인식하는 포획 항체와 검출 항체) 사이에 포획하여 “샌드위치” 형태를 이루기 때문에 이러한 이름이 붙었어요. 샌드위치 ELISA는 높은 민감도와 특이성 덕분에 가장 많이 사용되고 있어요.

 

 

 

 

 

 

직접 검출 방법 (Direct detection method)
직접 검출은 효소 또는 태그가 결합된 1차 항체가 항원에 직접 반응하는 방식이에요. 이 방식은 플레이트에 직접 고정된 항원이나 포획 형식을 사용해 수행될 수 있어요. 직접 검출은 ELISA에서는 흔하지 않지만, 조직 및 세포의 면역조직화학적 염색에서 널리 사용돼요.

 

직접 ELISA 검출은 단일 항체와 적은 단계로 이루어지기 때문에 빠르게 수행할 수 있으며, 2차 항체의 교차 반응성을 배제할 수 있다는 장점이 있어요. 하지만, 1차 항체에 효소나 태그를 결합하면 항체의 면역반응성이 저하될 수 있으며, 각 ELISA 시스템에 맞춰 1차 항체를 표지하는 작업은 시간이 많이 걸리고 비용이 많이 들어요. 또한, 시판되는 표지된 1차 항체의 종류가 제한적이고, 실험 간에 1차 항체의 라벨을 유연하게 선택할 수 없으며, 신호 증폭이 최소화된다는 단점이 있어요.

간접 검출 방법 (Indirect detection method)
간접 검출은 표지된 2차 항체나 비오틴-스트렙타비딘 복합체를 사용해 신호를 증폭하며, ELISA에서 가장 널리 사용되는 형식이에요. 2차 항체는 1차 항체에 특이적으로 반응해요. 샌드위치 ELISA에서는 2차 항체가 오직 1차 항체만을 검출하도록 설계하는 것이 중요한데, 포획 항체와 결합할 경우 항원에 대해 특이적이지 않은 결과를 초래할 수 있기 때문이에요. 일반적으로 포획 항체와 1차 항체를 다른 숙주 종에서 유래하도록 선택해 (예: 마우스 IgG와 래빗 IgG) 이러한 문제를 해결해요. 샌드위치 ELISA에서는 2차 항체가 포획 항체에 대한 친화성이 있는 항체를 제거하도록 교차 흡착된(cross-adsorbed) 2차 항체를 사용하는 것이 유리해요.

 

 

간접 ELISA 검출은 다양한 표지된 2차 항체가 시판되고 있어 선택의 폭이 넓으며, 한 종에서 만든 여러 1차 항체에 동일한 표지 2차 항체를 사용할 수 있어 유연성이 뛰어나요. 1차 항체는 라벨링되지 않아 최대의 면역 반응성을 유지할 수 있으며, 각 1차 항체가 여러 에피토프를 포함해 표지된 2차 항체가 결합할 수 있어 신호 증폭이 가능하다는 장점이 있어요. 또한, 동일한 1차 항체로 다양한 검출 방법(발색법, 화학 발광법 등)을 사용할 수 있습니다. 그러나, 2차 항체의 교차 반응성이 발생할 수 있어 비특이적 신호가 나타날 수 있으며, 실험 절차에 추가적인 인큐베이션 단계가 필요합니다.

 

 

 

샌드위치 ELISA (Sandwich ELISA)

샌드위치 ELISA는 포획 항체와 검출 항체 두 개가 항원에 대해 각각 결합하므로 타겟 항원에 대한 높은 민감도와 높은 특이성을 가져요. 또한, 동일한 포획 항체를 사용하여 다양한 검출 방법을 적용할 수 있어요. 하지만, 적합한 항체 쌍을 식별하고 포획 및 검출 항체 간 교차 반응성을 최소화하기 위해 추가적인 최적화가 필요해요.

 

경쟁적 ELISA (Competitive ELISA)
경쟁적 ELISA는 항원이 작고 하나의 에피토프나 항체 결합 부위만 있는 경우에 자주 사용되는 방법이에요. 이 방법의 한 변형으로, 항체 대신 정제된 항원을 표지하여 사용하기도 합니다. 시료의 비표지된 항원과 표지된 항원이 포획 항체에 결합하기 위해 경쟁하게 되는데, 표지된 항원의 신호가 감소하면 시료에 항원이 존재함을 나타냅니다. 이는 표지된 항원만 있는 웰과 비교하여 확인할 수 있어요.

 

 

경쟁적 ELISA (Competitive ELISA)
경쟁적 ELISA는 항원이 작고 하나의 에피토프나 항체 결합 부위만 있는 경우에 자주 사용되는 방법이에요. 이 방법의 한 변형으로, 항체 대신 정제된 항원을 표지하여 사용하기도 해요. 시료의 비표지된 항원과 표지된 항원이 포획 항체에 결합하기 위해 경쟁하게 되는데, 표지된 항원의 신호가 감소하면 시료에 항원이 존재함을 나타내. 이는 표지된 항원만 있는 웰과 비교하여 확인할 수 있어요.

 

 

 

 

그 밖에, ELISPOT, 혹은 in-cell ELISA와 같은 변형된 실험방법도 존재해요.

 

 

 

 

 

ELISPOT(enzyme-linked immunospot assay)은 ELISA와 유사하게 세포가 분비하는 단백질을 PVDF 막이 있는 미세플레이트 웰에 포획하고 측정하는 실험이에요. 이 "샌드위치" 분석에서 단백질은 세포가 분비하는 즉시 국소적으로 포획되고, 검출은 침전되는 기질을 사용해 이루어져요. 결과가 막 표면에 반점 형태로 나타난다는 점에서 ELISPOT은 웨스턴 블롯과 유사해요.

 

 

 

 

인셀 ELISA는 표준 미세플레이트에 세포를 도말하고 하룻밤 배양한 후에 수행돼요. 배양된 세포는 고정, 투과, 차단 과정을 거쳐 표적 단백질을 항체로 탐지하는 방식으로 진행되죠. 이는 간접 분석으로 샌드위치 형식이 아니며, 2차 항체는 형광 표지(형광 플레이트 판독기나 현미경으로 직접 측정) 또는 효소 결합(가용성 기질을 사용해 플레이트 판독기로 검출) 방식으로 사용할 수 있어요.

 

 

 

다음 포스트에서는 ELISA를 위해 필요한 요소들과 각 단계들에 대해 보다 더 자세하게 알아보도록 할게요.