ELISA의 원리, 단계, 응용 - 2

 

 

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어 ELISA 실험에서의 각 단계, 그리고 고려해야할 사항들에 대해 자세히 알아보도록 해요.

 

 

ELISA 플레이트

 

 

 

 

새로운 항원(Antigen)에 대한 ELISA를 개발할 때, 첫 번째 단계는 항원이나 포획 항체(Capture Antibody)의 플레이트 코팅 조건을 최적화하는 거예요. 여기에서 중요한 점은 단백질 결합 능력(Protein Binding Capacity)이 최소 400 ng/cm²인 실험용 마이크로플레이트(Microplate)를 선택하는 거죠. 특히 변동 계수(Coefficient of Variation, CV)가 5% 미만이면, 같은 조건의 웰(Well)과 플레이트 사이에서 실험 결과가 일관되게 나올 확률이 높아요.

 

신호 유형에 따라 플레이트 색상도 달라지는데요, 컬러리메트릭(Colorimetric) 신호는 투명한 폴리스티렌(Polystyrene) 평저 플레이트를, 형광(Fluorescence) 및 케미루미넌트(Chemiluminescent) 신호는 불투명한 검정색 또는 흰색 플레이트를 사용하는 게 좋아요. 실험 전에 플레이트를 시각적으로 검사해서 스크래치나 결함이 있는지 확인하는 것도 중요하고요. 

 

 

 

 

plate 코팅

 

ELISA 플레이트 코팅은 **단백질을 플레이트의 플라스틱 표면에 수동적으로 흡착(Passive Adsorption)시키는 방식으로 이루어져요. 이 과정은 플라스틱과 비극성 단백질 잔기(Non-polar Protein Residues) 간의 소수성 상호작용(Hydrophobic Interaction)을 통해 일어나죠. 일반적인 코팅 방법은 2–10 μg/ml 농도의 단백질 용액(Protein Solution)을 염기성 완충액(Alkaline Buffer)에 녹여 사용하는 건데요, 보통 인산염 완충액(Phosphate-buffered Saline, pH 7.4)이나 탄산염-중탄산염 완충액(Carbonate-bicarbonate Buffer, pH 9.4)에 녹인 단백질을 4–37°C에서 몇 시간에서 하룻밤 정도 둬서 코팅하는 거예요.

 

 

코팅 후 남은 용액을 제거하고 블로킹 버퍼(Blocking Buffer)를 추가해서, 남아있는 플라스틱의 결합면이 모두 덮이도록 하는데요, 코팅된 플레이트는 바로 사용할 수도 있고, 단백질의 안정성(Stability)에 따라 건조 후 4°C에 보관해 두고 나중에 사용할 수도 있어요.

 

코팅 조건(Coating Condition)과 결합 용량(Binding Capacity)은 단백질/항체에 따라 달라질 수 있어요. 이를 실험적으로 최적화하는 게 중요한데요, 경쟁 ELISA(Competitive ELISA)를 제외하고는 실험에서 실제로 결합될 수 있는 양보다 더 많은 포획 단백질로 플레이트를 코팅해서 최대한 넓은 검출 범위를 확보할 수 있도록 해요. 특정 단백질이나 항체는 최적 결합 용량보다 낮은 농도로 코팅해야 비특이적 결합(Nonspecific Binding)을 방지할 수 있고요. 후킹(Hooking) 현상이 생기면, 세척 시 결합되지 않은 단백질을 효과적으로 제거하기 어려워져 배경 신호가 증가하고, 이로 인해 신호 대 잡음 비율(Signal-to-Noise Ratio)과 실험 민감도(Sensitivity)가 떨어지게 됩니다.

 

ELISA용 1차 항체 (primary antibody)

 

 

 

샌드위치 ELISA(Sandwich ELISA)나 다른 ELISA 시스템에서 포획 항체(Capture Antibody)와 검출 항체(Detection Antibody)로 단클론 항체(Monoclonal Antibody)나 다클론 항체(Polyclonal Antibody)를 사용할 수 있어요. 단클론 항체는 특정 항원에서 하나의 에피토프(Epitope)에만 특이적으로 결합하므로, 작은 항원 차이를 정밀하게 검출하고 정량화할 수 있죠. 반면, 다클론 항체는 항원을 최대한 많이 잡아낼 수 있어 포획 항체로 자주 사용되고, 이후 샌드위치 방식에서는 단클론 항체가 검출 항체로 사용되어 특이성이 더욱 높아져요.

 

 

또한, 기존 단클론 항체 외에 재조합 단클론 항체(Recombinant Monoclonal Antibody)도 ELISA에 활용될 수 있는데요. 이 항체들은 특정 항체의 무거운 사슬과 가벼운 사슬 DNA 서열을 발현하도록 설계된 세포주에서 만들어져요. 하이브리도마(Hybridoma)에서 유래된 전통적인 단클론 항체와 달리, 재조합 항체는 세포주 유전자 변이(Cell-line Drift)나 배치 간 변이(Lot-to-lot Variation)에 영향을 받지 않아 항원에 대한 최상의 특이성을 유지할 수 있어요.

 

 

샌드위치 ELISA 설계 시 고려사항

 

 

샌드위치 ELISA를 설계할 때 중요한 점은 포획 항체와 검출 항체가 서로 다른 두 개의 비중첩(non-overlapping) 에피토프를 인식해야 한다는 거예요. 항원이 포획 항체에 결합할 때, 검출 항체가 인식하는 에피토프가 가려지거나 변형되지 않아야 해요. 서로 간섭하지 않으면서 동시에 결합할 수 있는 포획 항체와 검출 항체를 매칭 쌍(Matched Pairs)이라고 하며, 샌드위치 ELISA를 개발하는 데 적합하죠. 대부분의 1차 항체 공급업체는 ELISA에서 검증된 매칭 쌍을 제공하니 참고할 수 있어요.

 

 

블로킹 버퍼 (blocking buffer)

 

 

 

 

ELISA 실험에서 마이크로플레이트(Microplate)의 웰은 보통 단백질 코팅 용량보다 더 높은 결합 능력을 가지고 있어요. 따라서 항체나 다른 단백질이 불필요하게 플레이트에 흡착되는 것을 막기 위해 남은 표면을 블로킹해야 해요. 블로킹 버퍼는 비특이적 단백질(Irrelevant Protein), 혼합 단백질(Mixture of Proteins), 또는 기타 화합물로 이루어져서 플레이트의 모든 남은 결합면에 수동적으로 흡착되도록 해요. 좋은 블로킹 버퍼는 배경 신호를 줄이고 신호 대 잡음 비율(Signal-to-Noise Ratio)을 향상시켜 민감도를 높여줘요. 최적의 블로킹 버퍼는 항체가 결합할 수 있는 에피토프를 가리거나 변형시키지 않으면서 비특이적 결합이 일어날 수 있는 모든 부위에 결합해서 배경 신호를 제거해야 해요.

 

 

새로운 ELISA를 개발할 때에는 여러 블로킹 버퍼를 테스트해서 신호 대 잡음 비율이 가장 높은 것을 선택하는 것이 중요해요. 다양한 단백질 간 상호작용이 샘플과 항체에 따라 다르게 나타날 수 있어 비특이적 결합이 영향을 받을 수 있거든요. 블로커를 선택할 때 가장 중요한 요소는 신호 대 잡음 비율이에요. 타겟 분석 물질을 포함한 샘플에서 얻은 신호와 타겟 분석 물질이 없는 샘플에서 얻은 신호를 비교해서 신호 대 잡음 비율을 측정해요. 불충분한 양의 블로커를 사용하면 배경이 증가하고 신호 대 잡음 비율이 낮아지게 되는데, 반대로 너무 높은 농도의 블로커를 사용하면 항체와 항원 간 상호작용을 방해하거나 효소를 억제해 신호 대 잡음 비율이 떨어질 수 있어요. 최적의 블로킹 조건을 찾기 위해 실험적으로 테스트하는 것이 중요해요.

 

 

워시 버퍼(wash buffer)의 역할

ELISA의 각 단계 사이에서는 철저한 세척이 필수예요. 세척 단계는 결합되지 않은 시약을 제거해 배경을 줄이고 신호 대 잡음 비율을 높여주는데요, 세척이 부족하면 배경이 높아지고, 과도한 세척은 웰에서 항체나 항원을 유출시켜 민감도가 감소할 수 있어요. 세척은 트리스 완충 생리 식염수(Tris-buffered Saline, TBS)나 인산염 완충 생리 식염수(Phosphate-buffered Saline, PBS)와 같은 생리학적 완충액을 사용하는데, 여기에 0.05% Tween-20과 같은 세제가 첨가되어 비특이적으로 결합된 물질을 효과적으로 제거할 수 있어요. 또 다른 방법으로는 희석된 블로킹 버퍼에 세제를 첨가해 세척 버퍼로 사용하는 것이에요. 고순도 세제를 사용해서 효소 억제제나 과산화물과 같은 불순물이 들어가지 않도록 하는 것도 중요해요.

 

 

 

ELISA 신호의 검출

 

모든 ELISA 시스템의 마지막 단계는 검출 단계로, 방사성 또는 형광 표지를 사용하지 않는 한 효소 기질(Enzyme Substrate)을 도입해요. 이 효소는 기질을 검출 가능한 산물로 전환하는데요, ELISA가 올바르게 구축되고 개발되었다면, 기질을 추가했을 때 생성되는 신호 강도는 플레이트에 포획된 항원의 양과 검출 시약에 의해 결합된 양에 비례하게 됩니다. 특히 HRP(Horseradish Peroxidase)와 같은 효소가 결합된 항체(Enzyme-conjugated Antibody)는 다양한 기질을 사용할 수 있어 색소성, 화학 형광, 화학 발광 등 다양한 검출 및 문서화 방법을 제공해요.

 

 

색소성 기질 (Colorimetric Substrate)

색소성 기질은 용해성의 유색 산물을 형성해요. 이 산물은 각 웰에 있는 효소의 양에 따라 시간이 지남에 따라 축적되는데, 원하는 색상 강도에 도달하면 제품의 흡광도를 직접 측정하거나, 경우에 따라 정지 용액을 추가해 고정된 최종 측정치를 만들 수 있어요. 색소성 기질로는 HRP용 TMB, OPD, ABTS와 알칼리성 인산효소(Alkaline Phosphatase, AP)용 PNPP가 있어요. 형광 또는 화학 발광 기질보다 민감도는 낮지만, 색소성 ELISA 기질은 직접적인 시각화가 가능하며, 많은 실험실에서 흔히 사용하는 표준 흡광도 플레이트 리더로 검출할 수 있어요.

 

화학 발광(Chemiluminescent) 기질

화학 발광은 화학 반응을 통해 빛의 형태로 에너지가 방출되는 현상이에요. 대부분의 화학 발광 기질은 HRP에 의존하지만, 일부 AP용 기질도 있어요. 가장 일반적인 방식은 HRP와 과산화물 완충액(Peroxide Buffer)이 있는 루미놀(Luminol)을 사용하는 건데요, 루미놀은 산화되어 들뜬 상태의 산물을 형성하고, 이 산물이 바닥 상태로 돌아가면서 빛을 방출해요. 빛의 방출은 효소-기질 반응 중에만 발생하기 때문에 기질이 다 소모되면 신호가 사라져요. 화학 발광 검출은 일반적으로 색소성 검출보다 민감도가 높지만, 신호 강도가 다른 기질보다 더 변동할 수 있다는 단점이 있어요. 특히 여러 개의 플레이트를 읽어야 하는 실험에서는 신호가 빠르게 감소하면 문제를 일으킬 수 있으므로, 기질을 최적화해 신호 감소를 낮은 항원 농도로 오인하지 않도록 주의해야 해요. 

 

화학 형광(Chemifluorescent) 기질

형광 ELISA 기질은 흔하지 않으며, 특정한 활성화 빔(Excitation Beam)을 생성하는 형광 측정기가 필요해요. 화학 형광 검출도 효소 기반이지만, 생성되는 산물이 형광성을 가지고 있어서, 색소성 기질과는 달라요. 신호는 특정한 여기 및 방출 필터가 장착된 형광 측정기를 사용해 측정돼요. 화학 형광 반응은 시간이 지나면서 측정할 수도 있고, 정지 용액을 사용해 신호를 고정한 후 직접 측정할 수도 있어요.

 

 

 

이번 시리즈에서는 ELISA에 대해 알아봤어요. 추가적으로 궁금한 점 혹은 디테일한 점들을 질문해주시면 그와 관련된 포스트를 제작해보도록 할게요. 즐거운 실험하세요!