웨스턴 블롯(Western blot)의 원리, 단계, 응용 - 3

 

 

2024.10.27 - [전공자를 위한 생물학/실험] - 웨스턴 블롯(Western blot)의 원리, 단계, 응용 - 2

웨스턴 블롯(Western blot)의 원리, 단계, 응용 - 2

 

 

 

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어서 항체를 이용한 단백질 검출 과정들 각각에 대해 자세히 알아볼게요.

 

 

 

1차, 2차 항체 처리

 

 

 

웨스턴 블롯에서 1차 항체(primary antibody)는 막의 비특이적 부위를 차단한 후, 특정 단백질이나 단백질 그룹의 특정 항원 결정 부위(epitope)를 인식하는 데 사용돼요. 웨스턴 블롯에 사용할 1차 항체를 선택할 때는 검출하고자 하는 항원과 해당 항원에 대한 항체가 사용 가능한지를 고려해야 해요. 또한, 모든 1차 항체가 웨스턴 블롯에 적합한 것은 아니므로 새로운 항체를 구입하기 전, 가능하다면 그 용도가 웨스턴 블롯에서 검증되었는지 확인하는 것이 중요해요.

 

 

대부분의 경우, 웨스턴 블롯에서 목표 단백질을 인식하는 1차 항체는 직접적으로 검출되지 않아요. 그래서 간접 검출(indirect detection)을 위해 표지된 2차 항체(secondary antibody)를 사용하여 최종적으로 목표 항원을 검출해요. 2차 항체는 1차 항체가 생성된 동물 종(예: 마우스 항체라면 항-마우스 항체)이나 1차 항체에 연결된 태그(예: 비오틴(biotin), 히스티딘(histidine, His), 헤마글루티닌(HA) 등)에 따라 선택하죠. 예를 들어, 1차 항체가 변형되지 않은 마우스 단일클론 항체라면, 2차 항체는 마우스가 아닌 다른 숙주에서 얻은 항-마우스 IgG 항체가 되어야 해요.

 

 

웨스턴 블롯용 항체는 일반적으로 희석된 용액으로 사용되며, 제조사는 1 mg/mL 용액에서 1/100에서 1/500,000 범위의 희석을 권장하기도 해요. 하지만 최적의 희석 비율은 실험을 통해 확인하는 것이 중요해요. 민감도가 높은 검출 시스템일수록 적은 양의 항체로도 충분한 신호를 얻을 수 있어, 항체 비용을 절감하고 한정된 항체를 더 많은 실험에 활용할 수 있어요. 항체 희석은 일반적으로 세척 완충액에 만들어지며, 세제와 소량의 차단제가 포함된 항체 희석액은 배경 신호를 최소화해 신호 대 잡음비를 증가시키는 데 도움을 줘요.

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검출 방법

 

2차 또는 1차 항체에 결합할 수 있는 태그는 많지만, 검출 방법에 따라 사용할 태그가 제한될 수 있어요. 과거에는 방사성 동위원소가 널리 사용되었지만, 비용이 많이 들고 짧은 유효기간, 신호 대 잡음비 개선 효과가 없고, 특별한 취급 및 폐기가 필요해 현재는 잘 사용되지 않아요. 대신 효소나 형광체(fluorophore)가 주로 사용돼요.

 

 

웨스턴 블롯에서는 주로 효소 표지가 많이 사용되며, 최적화된 기질과 함께 사용하면 매우 높은 민감도로 단백질을 검출할 수 있어요. 말초산화효소(horseradish peroxidase, HRP)와 알칼리성 인산분해효소(alkaline phosphatase, AP)가 가장 널리 사용되며, 각 효소에 맞는 크로모제닉, 형광제, 발광화학적 기질들이 준비돼 있어요. 특히, 알칼리성 인산분해효소는 반응 속도가 선형(linear)을 유지해 반응 시간을 연장해 감도를 높일 수 있어요. 하지만 긴 반응 시간은 높은 배경 신호로 이어져 신호 대 잡음비를 낮출 수 있죠. HRP 결합 항체는 효소 크기가 작고 다양한 결합 반응에 호환되며, 높은 반응 속도, 좋은 안정성, 저렴한 비용, 널리 사용 가능한 기질로 인해 대부분의 응용에 적합해요.

 

 

효소 결합 항체는 다양한 기질로 인해 웨스턴 블롯의 검출과 문서화 방법에서 유연성을 제공해요. 가장 간단한 방법은 크로모제닉 기질을 사용해 신호를 직접 시각화하는 것이에요. 하지만 크로모제닉 기질은 민감도가 낮고 시간이 지나면 블롯이 건조되거나 저장 중에 신호가 사라질 수 있어요. 따라서 결과를 영구적으로 보관하려면 복사하거나 스캔해두는 것이 필수죠.

 

 

 

발광화학적 블롯 기질(chemiluminescent substrate)은 효소-기질 반응의 순간적인 산물로 신호가 생성되며, 반응이 계속되는 동안에만 신호가 유지돼요. 최적화된 실험에서 충분한 기질을 사용하면 신호가 1시간에서 24시간 동안 안정적으로 유지될 수 있어 X선 필름이나 디지털 이미징 장비를 사용해 민감하고 안정적인 검출이 가능해요. X선 필름은 반정량적 데이터를 얻는 데 유용하지만, 디지털 이미징은 더 넓은 동적 범위를 제공해 정량 데이터도 얻을 수 있답니다.

 

 

 

 

마지막으로 형광체 결합 항체(fluorophore-conjugated antibody)는 기질을 처리하는 단계가 필요 없어서 단계가 적어요. 프로토콜은 간단하지만, 형광 신호를 감지하고 기록하기 위해 특수 장비와 빛을 조사하는 광원이 필요해요. 디지털 이미징 기술의 발전과 적외선, 근적외선, 퀀텀 닷(quantum dot)과 같은 신세대 형광체 개발 덕분에 웨스턴 블롯과 다른 면역 분석에서 형광 탐침(fluorescent probe) 사용이 증가했어요. 장비와 형광체 결합 항체는 비용이 높을 수 있지만, 여러 형광체를 한 실험에 사용할 수 있어 실험의 효율성을 높이고, 다른 블롯 방식에 비해 화학적 폐기물도 줄일 수 있어요.

 

 

지금까지 웨스턴 블롯에 대해 알아봤어요. 추가적으로 궁금한 점 혹은 디테일한 점들을 질문해주시면 그와 관련된 포스트를 제작해보도록 할게요. 즐거운 실험하세요!