웨스턴 블롯(Western blot)의 원리, 단계, 응용 - 2

 

 

지난 글에서는 웨스턴 블롯의 기본적인 원리에 대해 간략히 알아봤어요.

 

2024.10.27 - [전공자를 위한 생물학/실험] - 웨스턴 블롯(Western blot)의 원리, 단계, 응용 - 1

웨스턴 블롯(Western blot)의 원리, 단계, 응용 - 1

 

 

이번 포스트에서는 웨스턴 블롯의 구체적인 단계들, 그 중에서도 항체를 처리하기 전까지의 과정들에 대해 자세히 알아보도록 할게요.

 

 

단백질의 분리

 

 

 

 

 

젤 전기영동(gel electrophoresis)은 단백질이나 DNA와 같은 전하를 띤 분자를 전기장의 힘으로 젤(gel)을 통과시키면서 물리적 특성에 따라 분리하는 기법이에요. 단백질은 일반적으로 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE)을 통해 분리하고, 복잡한 샘플 속 개별 단백질을 특성화하거나 단일 샘플 내 여러 단백질을 분석하는 데 주로 사용돼요. 웨스턴 블롯팅과 결합하면, PAGE는 단백질의 질량(mass), 전하(charge), 순도(purity), 존재 유무에 관한 중요한 정보를 제공하는 강력한 분석 도구가 되죠.

 

 

 

PAGE에는 여러 종류가 있어, 원하는 단백질에 대해 다양한 정보를 얻을 수 있어요. 예를 들어, 비변성 PAGE(nondenaturing PAGE 또는 native PAGE)는 단백질을 질량-전하 비(mass-charge ratio)에 따라 분리하고, SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulfate-PAGE)는 SDS라는 제의 일종에 해당하는 물질을 이용해 단백질을 음전하로 띠게 하여 질량에 따라 분리합니다.

 

단백질 전기영동에는 여러 가지 완충 시스템(buffering systems)이나 젤 화학(gel chemistries)이 있으며, 각각이 다른 분자량의 단백질을 분리할 때 고유한 이점을 제공해요.

 

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단백질 전이 (transfer)

 

 

 

전기영동 후 단백질은 젤(gel)에서 막(membrane)으로 옮겨져야 해요. 이를 위한 다양한 방법들이 있으며, 확산 전이(diffusion transfer), 모세관 전이(capillary transfer), 진공 블롯 전이(vacuum blotting transfer), 전기추출(electroelution) 등이 있어요. 그중에서도 단백질 전이에는 빠르고 효율적인 전기추출 또는 전기영동 전이(electrophoretic transfer)가 가장 일반적으로 사용됩니다. 이 방법은 단백질의 전기 이동성(electrophoretic mobility)을 이용해 젤에서 막으로 단백질을 옮기는 방식이에요. 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel)을 단백질이 잘 결합할 수 있는 니트로셀룰로스(nitrocellulose) 같은 막과 직접 접촉시키고, 이를 전도성 용액에 잠긴 두 전극 사이에 배치해 전이를 진행하게 되는데요. 이 과정에는 다공성 패드와 필터 종이를 사용해 전이 효율을 높이죠. 전기장을 걸어주면 단백질이 젤에서 빠져나와 막 표면에 단단히 결합하게 되고, 결과적으로 젤의 단백질 패턴이 막에 그대로 복사돼요.

 

 

전이 후 웨스턴 블롯을 진행하기 전에 막에 있는 총 단백질을 염색해 전이 효율을 확인할 수 있어요. 젤을 염색해 단백질이 젤에서 빠져나왔는지 확인할 수도 있지만, 이는 단백질이 막에 효율적으로 결합되었는지 보장하지는 않아요. 염료가 항체 결합 및 검출에 방해가 될 수 있기 때문에, 쉽게 제거할 수 있는 단백질 염색제가 이상적이죠. Ponceau S 염색은 막에서 단백질을 가역적으로 염색하는 데 가장 일반적으로 사용되지만, 감도가 낮고 사진 촬영이 어렵다는 단점이 있어요. 최근에는 니트로셀룰로스(nitrocellulose)나 PVDF(polyvinylidene difluoride) 막에 사용할 수 있는 고감도 염색제가 많이 나와 있으며, 이들은 나노그램(nanogram) 수준의 단백질을 검출할 수 있고 쉽게 촬영 가능하며, 제거 전까지 사라지지 않는 장점이 있어요.

 

 

참고로 여러 가지 전기 전이 방식이 있으며, 대표적으로 습식(wet), 반건식(semi-dry), 건식(dry) 전이 방식이 있어요. 각 방식은 시간, 비용, 필요한 시약과 장비 측면에서 각각의 특성이 있습니다. 습식 전이(또는 탱크 전이, tank transfer)는 높은 전이 효율과 완충 시스템 및 방법 선택의 유연성을 제공하지만, 시간과 노력이 많이 들어요. 반건식 전이는 여러 완충 시스템을 사용할 수 있고, 간편하며 시간 절약이 가능해요. 하지만 반건식 전이는 분자량이 큰 단백질(>300 kDa)의 전이 효율이 낮을 수 있습니다. 건식 전이는 빠르고 고품질의 전이가 가능하며, 완충액이 필요하지 않기 때문에 편리하지만, 소모품 선택이 제한적이에요.

 

 

블로킹 (blocking)

 

 

 

웨스턴 블롯(Western blot)에 사용되는 막(membrane)은 단백질에 대한 높은 친화력을 가지고 있어요. 따라서 젤(gel)에서 단백질을 막으로 전이한 후에는, 이후 단계에서 검출 항체가 비특이적으로 결합하지 않도록 막의 나머지 표면을 차단하는 것이 중요해요. 이를 위해 우유(milk)나 일반 혈청(normal serum)부터 고도로 정제된 단백질까지 다양한 차단 완충액(blocking buffer)이 사용되며, 비특이적 결합을 줄여 배경 신호를 줄이고 신호 대 잡음비(signal-to-noise ratio)를 향상시키는 역할을 하죠. 그러나 모든 실험에 완벽히 맞는 차단제가 있는 것은 아니에요. 항체-항원 쌍마다 고유한 특성이 있으므로, 차단 완충액을 실험에 맞게 최적화하기 위해 경험적인 테스트(empirical testing)가 필수적이에요. 많은 경우 연구실에서 차단 완충액을 만들지만, 상용으로 제공되는 차단 완충액을 사용하면 편리해요.

 

 

Wash buffer를 이용한 washing (세척)

 

 

 

 

웨스턴 블롯 절차는 다양한 면역화학적 시약으로 여러 번의 반응을 거치며, 각 반응 사이에는 필수적으로 세척 단계(wash steps)가 필요해요. 세척 단계는 결합되지 않은 시약을 제거하고 배경 신호를 줄여 신호 대 잡음비를 증가시키기 위해 필요한데요. 세척이 부족하면 배경 신호가 높아질 수 있고, 과도한 세척은 항체나 항원이 블롯에서 용출되면서 민감도가 낮아질 수 있어요. 웨스턴 블롯의 다른 단계와 마찬가지로, 다양한 완충액(buffer)을 사용할 수 있어요.

 

 

가장 일반적으로 사용하는 세척 완충액은 Tris-완충 염용액(Tris-buffered saline, TBS)과 인산염-완충 염용액(phosphate-buffered saline, PBS)입니다. 대부분의 경우, PBS와 TBS는 교체해서 사용할 수 있지만 특정 상황에서는 하나를 다른 것보다 더 선호해야 해요. 예를 들어, AP-결합 2차 항체(alkaline phosphatase-conjugated secondary antibody)를 사용할 때나 인산화 단백질(phosphorylated protein)을 인산특이적 항체(phospho-specific antibody)로 검출할 때는 TBS를 사용하는 것이 좋아요.



때때로 세척 완충액에 0.05% Tween 20과 같은 세제를 포함해 비특이적으로 결합된 물질을 제거하는 데 도움을 줄 수 있어요. 실험 조건에 따라 세척 완충액에 들어가는 세제의 양은 다를 수 있으며, 보통 Tween 20과 같은 세제는 0.05%에서 0.5% 정도의 농도로 사용됩니다. 또 다른 일반적인 기법으로는 차단 용액을 세척 완충액에 1:10 비율로 희석해 넣는 것이 있어요. 세제와 함께 차단제를 포함시키면 차단 단백질이 막에서 용출되지 않도록 하면서, 비특이적 결합이 용액 내의 단백질과 반응하도록 유도해 배경 신호를 줄이는 데 도움을 줄 수 있어요.

 

 

세제는 단백질 용액과 마찬가지로 미생물 성장을 촉진할 수 있다는 점도 주의해야 해요. NP-40, CHAPS, Tween 20과 같은 세제를 미리 희석한 용액으로 준비하는 것이 편리할 수 있지만, 이 용액에서 곰팡이가 자라 배경 신호를 증가시킬 수 있어요. 또한, 세제에는 상당한 양의 과산화물이 포함될 수 있는데, 말초산화효소 기질(horseradish peroxidase substrate)을 사용할 때 배경 신호를 유발할 수 있어요. 따라서 고순도의 세제를 사용하는 것이 매우 중요하죠.

 

 

 

 

위 표에는 다양한 세척 완충액의 조성이 나와 있으므로 참고하셔도 좋을 것 같아요.

 

 

 

다음 포스트에서는 antibody를 결합시키는 과정, 그리고 그 이후에 신호를 읽어들이는 과정에 대해 자세히 다루어볼게요.