PCR(중합효소 연쇄반응)의 원리, 단계, 응용

 

이번 포스트에서는 대부분의 생물학 실험실에서 다 일상적으로 하는 실험 중 하나인 PCR(polymerase chain reaction)에 대해 알아볼게요.

 

 

 

특히나 요즘은 생물 실험을 하시는 분들뿐만 아니라 코로나 검사를 받아본 경험이 있는 분들도 PCR에 대해서 한번은 들어보셨을거같아요.

 

 

 

 

PCR은 polymerase chain reaction의 줄임말로, 쉽게 풀어서 설명하자면 polymerase, 즉 중합효소를 이용해서 소량의 DNA를 연쇄적으로(chain) 증폭시키는 반응(reaction)이에요. 실제로 위 그림에도 나와있는 것처럼 PCR 반응을 반복함에 따라서 DNA 양이 연쇄적으로 증폭되고, 결국 우리는 소량의 DNA랑 똑같은 정보를 담고 있는 수많은 DNA 복제본들을 얻을 수 있어요.

 

 

 

 

위 그림에 복잡하게 나타나 있는 것이 PCR 반응의 일부에요. 뭐가 많아서 복잡해보이지만, PCR의 한 cycle은 크게 1. DNA denaturation(이중가닥 DNA를 녹이는 과정), 2. primer annealing(primer를 복제하고자 하는 가닥에 붙여주는 과정), 3. polymerase extension(DNA 중합효소를 이용해서 primer로부터 DNA를 늘려나가는 과정)으로 구성되어 있어요.

 

 

이제 각각의 과정에 대해 조금 더 자세히 알아볼게요.

 

 

1. DNA denaturation

 

 

일단 첫 번째 단계는, 우리가 증폭하고자 하는 DNA를 denaturation(변성)시켜주는 거에요. 일반적으로 DNA는 위 그림 위쪽에 나타나 있는 것처럼 이중가닥으로 존재하고 있는데요. 이 상태로는 DNA 정보를 복제할 수가 없기 때문에, 염기 부분을 각각 드러나게끔 한 가닥씩 때주는 과정이 필요하고 그게 바로 denaturation인거죠.

 

 

denaturation을 위해서는 일반적으로 강한 열이 사용돼요. 보통 대략 92-95도 정도의 열을 가해주면 DNA 가닥이 위 그림 아래처럼 한가닥씩 잘 떨어져요.

 

 

2. primer annealing

 

 

다음으로 해야 할 일은 primer라는 녀석을 붙여주는 일이에요. 이 녀석을 붙여줘야 하는 이유는 단순한데, 바로 DNA 중합효소의 특징 때문이에요. 결국 DNA를 합성하는 일도 효소가 관여해서 일어나는 반응이고, 특별히 DNA를 합성할때 필요한 효소가 DNA polymerase(DNA 중합효소)에요. 

 

 

DNA polymerase는 위 그림과 같이 생겼어요. 이 때 주황색으로 나타나 있는 것이 기존에 존재하는 DNA이고, 초록색으로 나타나 있는 것은 DNA polymerase에 의해서 새롭게 만들어진 DNA에요.

 

 

그런데 이 DNA polymerase는 아예 처음부터 DNA 가닥을 합성해내지는 못하고, 무조건 3' OH가 존재해야 그곳으로부터 합성을 시작할 수 있어요.

 

 

 

 

이말이 무슨 말이냐..... 위 그림에서 빨간색으로 나타나 있는 것이 실제로 우리 몸에서 DNA가 복제될 때 필수적인 프라이머(primer)인데요. 이 녀석의 3' 말단이 제공하는 OH기가 있어야 DNA polymerase는 비로소 이 3' OH 말단으로부터 새로운 DNA를 합성해낼 수 있어요. 즉, 프라이머는 DNA polymerase의 합성을 시작하기 위해 꼭 필요한 녀석이에요.

 

 

 

따라서, 세포 밖에서 인위적으로 DNA를 합성할 때에도 DNA polymerase를 사용한다면 반드시 붉은색으로 나타나 있는 primer가 필요해요. 게다가, 이 경우에는, 어떤 프라이머를 사용하는지에 따라서 증폭될 서열의 범위를 지정할 수 있어요. 이게 무슨 말이냐??

 

 

실제로 붉은색으로 나타나 있는 프라이머 두 개를 사용해주게 되면, 노란색 박스로 표시된 부분만을 PCR을 통해 증폭해낼 수 있어요. 즉, PCR에서 프라이머는 DNA polymerase의 합성을 위해 필요한 3' OH말단을 제공해줄 뿐만 아니라 PCR을 통해 서열 중 어떤 부분을 증폭시킬지를 정해주는 경계선의 역할도 수행해줘요. 

 

 

그러다보니 일반적으로 우리가 증폭하고자 하는 서열이 생기면, 그 서열에 맞게 우리가 프라이머를 디자인한 뒤 주문해서 사용하는 경우가 대부분이에요.

 

 

프라이머를 디자인하는 방법은 다양하지만, 전 아래 사이트를 주요 이용해요.

 

 

PrimerQuest - design qPCR assays | IDT (idtdna.com)

 

 

이제 다음으로, 이 primer를 annealing한다는 의미는, 앞서 DNA denaturation을 통해 벌려놓은 DNA 가닥에 primer를 결합시키는 과정을 말해요. 일단 이 과정에서는 DNA를 denaturation시켰던 온도보다는 훨씬 온도를 낮춰줘야 하는데, primer의 종류에 따라 다르지만 보통 45-65도 사이에서 온도를 설정해요. 

 

 

Tm Calculator | Thermo Fisher Scientific - KR

Tm Calculator | Thermo Fisher Scientific - KR

 

위 사이트는 일반적으로 primer annealing 온도를 결정하기 위해 매우 중요한 Tm 값이라는 것을 계산해주는 사이트에요. 이에 대해서는 나중에 따로 포스트로 더 설명할 기회가 있을거에요.

 

 

3. polymerase extension

 

 

세 번째 단계는 이제 annealing된 프라이머를 시작으로 중합효소에 의해 중합을 진핸하는 단계에요. 

 

 

그런데 지금까지의 과정을 살펴보면, 온도를 95도까지 올렸다가 60도 아래로 내렸다가 하는데, 이렇게 온도를 확확 변화시키는 것이 단백질, 특히 효소의 입장에서는 상당히 민감할 수 있어요. 특히나 대부분의 효소는 95도 정도의 고온에 노출되면 대부분 다 망가져서 제 기능을 잃어버릴 수도 있어요.

 

 

그러다 보니 사람들은 이렇게 온도를 막 바꿔줘도 기능을 잃지 않는 DNA 중합효소를 찾았는데요. 바로 해저 열수구 같은 환경에서 사는 고세균이 가지고 있는 taq polymerase라는 중합효소에요.

 

 

이 녀석은 위와 같이 생겼어요. 생긴것만 봐서는 별 차이를 모르겠죠? 그렇지만 이 녀석은 엄청나게 열에 안정적이어서 PCR 반응을 진행시키며 온도를 왔다갔다 하더라도 제기능을 유지하고 있다가, 마지막으로 72도의 온도로 맞춰주면 DNA를 중합시킬 수 있어요.

 

 

 

이런 3개 단계를 계속 반복하면 우리가 원하는 수만큼 DNA를 증폭시켜줄 수 있어요. 실제로 이론적으로 이 방법을 이용하면 아주 극소량의 DNA로부터도 엄청나게 많은 수의 DNA를 얻어낼 수 있기 때문에, 엄청나게 파워풀한 기술이에요.

 

 

물론, 거의 모든 생물 실험실에서 이 실험을 하지만 사실 한 번에 성공하기 만만찮은 실험이기도 한데요.

 

 

실험이 실패하면 왜 실험이 실패했는지를 예상해보고, 조건을 하나하나 바꿔가면서 좋은 결과가 나올 때 까지 다시 해봐야겠죠?? 이 과정을 troubleshooting이라고 불러요.

 

 

PCR의 TroubleShooting : 네이버 블로그 (naver.com)

PCR의 TroubleShooting

 

NanoHelix에서 만든 PCR troubleshooting과 관련해서 참고할 만한 자료가 있어서 첨부해요. 실험이 잘 되지 않으시는 분들이라면 참고해보시면 될 것 같아요!