[형광단백질] 2편 : 형광 단백질 삽입, 과발현, 기능 확인, 최적화

 

 

 

1편에서는 형광 단백질을 단백질 말단(N- 또는 C-말단)에 붙이는 방법과 주의할 점을 알아봤어요. 

 

 

 

그런데 어떤 단백질은 말단이 기능적으로 너무 중요해서 형광 단백질을 양 끝에 붙일 수 없을 때도 있어요. 이럴 땐 어떻게 해야 할까요?

 

단백질 내부에 형광 단백질을 삽입할 수도 있어요

 

 

만약 단백질의 N-말단과 C-말단이 모두 기능에 필수적이라면, 형광 단백질을 단백질 내부에 삽입(insertion)하는 전략도 사용할 수 있어요. 다행히 GFP 계열 형광 단백질들은 N말단과 C말단이 가까운 구조라서, 중간 삽입이 비교적 가능하답니다.

 

그럼 어디에 삽입하면 좋을까요?

가장 좋은 위치는 2차 구조(알파헬릭스, 베타시트) 사이의 루프(loop)예요.

루프는 구조적으로 유연해서 삽입으로 인한 방해가 덜하고, 단백질 간 상호작용이 없는 부위를 선택하는 게 좋아요. 이때 단백질 구조 정보가 있다면 많은 도움이 돼요. PDB 구조나 AlphaFold 예측 데이터를 참고해도 좋아요.

실제로 Cdc42, G단백질의 알파 소단위체(Gα) 같은 단백질에서도 내부 삽입 방식으로 형광 단백질을 성공적으로 태깅한 사례가 있어요.

하지만 삽입 위치는 예측만으로 정답을 알 수 없기 때문에, 여러 위치에 삽입한 버전을 만들어보고 비교하는 실험이 중요해요. 랜덤 삽입을 위한 트랜스포존 기반 전략도 있고, 비교적 간단하게 여러 버전을 만들 수 있어요.

 

반응형

 

과발현 아티팩트를 피해야 해요

 

 

 

 

형광 단백질을 발현시키기 위해 플라스미드를 세포에 도입하면, 단백질이 비정상적으로 많이 만들어지는 경우가 있어요. 이걸 과발현(overexpression) 아티팩트라고 해요.

과발현이 심하면 원래 세포 내 환경과 달라져서, 단백질이 비정상적으로 분포하거나, 다른 단백질과 상호작용하지 못할 수도 있어요. 그래서 결과를 해석할 때 조심해야 해요.

요즘은 CRISPR/Cas9 기반의 게놈 편집 기술 덕분에, 내인성 유전자에 형광 단백질을 붙이는 방법도 많이 사용돼요.
이 방법을 쓰면, 원래 유전자 수준에서 발현되기 때문에 과발현 문제가 없고, 더 자연스러운 결과를 볼 수 있어요.

다만, 게놈 편집은 시간과 자원이 더 많이 들어가니까, 먼저 플라스미드 기반 퓨전 단백질을 만들어서 형광 위치와 기능이 잘 유지되는지 확인한 다음 게놈 편집에 도전하는 걸 추천해요.

 

퓨전 단백질의 기능이 잘 유지되는지 확인하려면?

 

형광이 잘 보인다고 해서, 퓨전 단백질이 기능까지 잘하고 있다는 보장은 없어요. 그래서 기능 검증이 정말 중요해요.

 

세포 내 위치(localization) 확인

면역염색(immunofluorescence)과 비교해서 원래 단백질 위치와 잘 맞는지 확인해요.

 

기능적 complementation
만약 해당 단백질을 knock-down 또는 knock-out한 세포에서, 퓨전 단백질이 기능을 회복시킨다면, 그건 매우 강력한 증거예요. 예를 들어, knock-out 세포에서 세포 기능이 정상화되면 퓨전 단백질이 제대로 작동하는 거예요.

 

상호작용이나 효소 활성 측정
이건 좀 더 까다롭지만, 퓨전이 단백질의 상호작용 또는 촉매 기능에 영향을 미쳤는지 확인하는 것도 좋아요. 물론 퓨전 단백질이 완벽하게 native protein과 똑같이 작동하지 않을 수도 있어요. 그렇지만, 세포 내에서 실시간으로 단백질을 관찰할 수 있다는 장점은 여전히 크기 때문에, 어느 정도의 한계는 감수하고 활용하는 경우가 많아요.

 

형광 단백질 퓨전 단백질을 만드는 일은 단순한 클로닝을 넘어서, 단백질의 구조와 기능을 이해하고, 실험 목적에 맞게 설계하는 정교한 작업이에요.

 

 

어떤 형광 단백질을 쓸지

어디에 붙일지 (N, C, 또는 내부)

링커는 필요할지

과발현 문제는 없는지

기능이 유지되는지

 

 

이런 것들을 꼼꼼히 따져가며 실험을 설계하면, 정확하고 재현성 있는 결과를 얻을 수 있어요.

 

형광 퓨전 단백질은 세포 안 단백질을 '직접 본다'는 꿈을 실현시켜준 멋진 도구예요. 현미경 아래에서 여러분의 단백질이 반짝이는 걸 보는 그 순간, 실험의 즐거움도 함께 느끼게 되실 거예요!