[분자생물학] 13.7 : histone code

 

 

이번 포스트에서는 histone code에 대해 알아보도록 하자.

 

 

한편 chromatin remodeling에 대해 다양한 연구가 이루어지다 보니, histone code가 발견됨. 이 histone code는 gene의 control region 주변에 있는 nucleosome에 일어나는 다양한 histone modification의 조합을 의미함. (어떤 조합의 modification에서는 전사가 activation되고, 어떤 조합의 modification에서는 전사가 repression됨)

 

이런 histone code에 의한 전사 조절은 epigenetic한데, 당연히 DNA 염기 그 자체에 변화를 유발하지는 않기 때문임.

 

 

 

histone code와 관련해서 많은 연구가 이루어진 것이 바로 IFN-beta gene임. (참고로 IFN-beta gene의 활성화에는 IFN-beta enhanceosome이라는 activator가 관여하며, 이 enhanceosome이 HAT의 일종인 GCN5를 recruit할 수 있어서 결국 histone acetylation이 유발됨. 참고로 아래에 앞서 살펴봤었던 8개 단백질이 모여 생기는 enhanceosome 구조를 첨부함.

 

 

 

 

그렇다면 구체적으로 IFN-beta gene과 관련해서 어떤 실험을 수행했을까.

 

 

 

IFN-beta gene의 promoter와 함께 주변부의 histone이 어떤 특정한 histone code를 가지게 될텐데, 이 때 시간 변화에 따라 histone의 modification 양상이 어떻게 변화하는지를 측정하기 위해 ChIP assay를 사용함. 물론 ChIP assay는 원래는 단백질과 결합하는 DNA fragment의 서열을 알아내기 위해 더 많이 사용하지만, DNA 서열을 알 경우 다양한 antibody를 넣어가면서 특정 단백질의 존재 여부도 알아낼 수 있음.

 

 

 

 

구체적인 실험 결과는 위 그림과 같음.

 

 

이 때 위쪽 그림의 오른쪽 부분에 나와 있는 것이 각종 antibody임. 예를 들어 alpha -acH4 K8의 경우 4번 histone의 8번 lysine residue에 acetylation이 일어나면 그 site를 인지할 수 있는 antibody에 해당함.

 

 

이런 식으로 다양한 antibody들을 이용해 특정 residue에 일어나는 histone modification이 시간에 따라 어떻게 바뀌는지를 살펴봄.

 

 

그 결과 acH4 K8이 가장 먼저 일어나는 modification 중 하나이고 그 다음으로 acH4 K12가 잠시 나타나며, 이어서 phH3 S10이 나타나고(H3 10번째 serine에 phoshorylation) acH3 (K14)가 나타남.

 

 

그런데 흥미롭게도 acH3 (K14)이 나타나는 timing과 TBP가 나타나는 timing이 거의 일치함. 이를 통해 histone modification, 그 중에서도 acH3 (K14)에 일어난 modification이 TBP를 불러오는 역할을 수행한다는 것을 알 수 있음. 이후에는 TBP가 다른 transcription factor들을 recruit하게 되므로 결과적으로 전사가 일어나게 됨. 그 결과 위 그림 맨 아래에 나타난 것과 같이 TBP가 DNA에 binding하는 시간과 거의 비슷한 시간대에 IFN-beta mRNA가 관찰되기 시작함. (시간 경과에 따라 서로 다른 histone modification이 순차적으로 일어나고, 결국 이것이 전사와 어떤 식으로든 관련되어 있다는 것이 이 실험의 핵심 결론임)

 

 

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그렇다면 가장 초기에 일어나는 acH4 K8 acetylation event는 어떤 효소에 의해서 일어나는가.

 

 

 

 

 

 

이를 알아보기 위해 immunodepletion 실험을 수행함. immunodepletion은 특정 단백질만을 특이적으로 없애기 위해 solution에 특정 단백질에 결합하는 antibody를 넣어줘서 특정 단백질만 가라앉혀버리는 방법임.

 

 

 

결과를 살펴보면 나머지의 경우에서는 alpha -acH4 K8에 의해 acH4 K8 부위에서의 acetylation이 확인되었지만, GCN5/PCAF를 빼준 경우에는 acH4 K8 부위에서의 acetylation이 관측되지 않음. 이를 통해 GCN5/PCAF가 acH4 K8 부위를 acetylation시켜주는 효소임을 알 수 있음.

 

 

 

 

한편 위 실험에서는 acetyl기를 제공해주는 acetyl-CoA와 activator 역할을 하는 enhanceosome을 넣거나 넣지 않아봤을 때 SWI/SNF의 일부인 BRG1(remodeling complex를 대표), 그리고 TFIID의 일부인 TAF1(general transcription factor를 대표)에 대한 band가 나타나는지를 확인해보았음.

 

 

참고로 이 때 1, 2, 3, 4번 lane에서는 HeLa cell로부터 추출한 chromatin을 사용하였는데, 이 경우 아마도 원래 HeLa cell 내부에 있을 때부터 어느 정도 acetylation이 이루어져 있어서 2번 lane에 원래는 없어야 할 신호가 관찰되는 것으로 생각되므로, E.coli에서 따로 histone을 만든 후에 DNA와 이들을 결합시켜 새로운 chromatin 구조를 만든 WT core의 경우에 해당하는 5, 6, 7, 8 lane의 결과를 살펴보자.

 

보면 acetyl-CoA와 enhanceosome이 모두 있을 때만 remodeling complex와 general transcription factor가 recruit된다는 것을 알 수 있음. 즉, 다시 말해 histone이 acetylation되어 있고 activator 역할을 하는 녀석도 있어야만 비로소 전사가 진행될 수 있음. (물론 이는 IFN-beta gene에서만 해당하는 이야기임) 물론 2에 비해 4에서의 band 굵기가 더 굵어지는 경향성이 있으므로, 이 또한 acetylation과 activator의 존재 둘 다가 어느 정도 전사의 활성화에 관련되어 있다는 사실을 말해주기는 함.

 

 

 

 

 

위 그림에 나타난 그림은 정말로 acetylation이 recruitment에 직접적인 관련이 있는지를 확인하기 위해 수행한 실험의 결과를 보여주고 있음.

 

 

기본적으로 이 실험에는 각종 histone을 구성하는 lysine들을 다른 amino acid로 바꿨을 때의 BRG1, TAF1 recruit 여부를 확인하는 방법이 사용됨. 예를 들어 위 그림에서 H4A8은 H4의 8번째 lysine을 alanine으로 바꿔준 mutant histone을 의미함. (당연히 이런 mutant를 만들기 위해서는 E.coli를 통해 mutant 단백질을 새로 합성해야 할 것임) 이렇게 돌연변이가 일어나면 원래는 acetylation이 일어나야 할 이 residue에 acetylation이 일어나지 않게 될 것임.

 

 

 

우선 H4A8의 결과를 봤더니 BRG1, TAF1에 대한 신호가 모두 관측되지 않음. 즉, 이 자리에 일어나는 acetylation이 SWI/SNF complex와 TFIID를 recruit하는 데 필수적이라는 것을 알 수 있음. 다음으로 H3A14, H3A9의 결과를 살펴보면 BRG1에 대한 신호는 관측되었지만 TFIID에 대한 신호는 관측되지 않았음. 즉, 이 자리들에 일어나는 acetylation은 (SWI/SNF complex의 recruit에는 크게 관여하지 않고) TFIID를 recruit하는 데만 필수적으로 작용함을 알 수 있음.

 

 

 

이러한 단편적인 실험 결과들을 바탕으로 결국 IFN-beta gene과 관련된 histone code model을 아래와 같이 정리할 수 있음.

 

 

 

 

 

enhancer에 enhanceosome이 붙은 후 이 enhanceosome에 의해 GCN5라는 일종의 HAT protein이 recruit됨. GCN5는 주변의 histone 단백질을 acetylation시키고, 이후 enhanceosome에 의해 recuit된 또 다른 kinase가 다른 부위를 phosphorylation시킴. 이에 더해 순차적으로 여러 histone modification이 일어나게 됨. 그 결과 histone code가 구성됨.

 

 

 

이 histone code를 인식하고 SWI/SNF가 결합하게 되면 histone remodeling에 의해 DNA 부분이 loosening되게 되고(위 그림에서 구불구불한 DNA 모양으로 loosening을 표현) 이 덕분에 TATA box와 같은 DNA 영역이 histone 밖으로 노출됨. 한편 TFIID는 이 TATA box를 인지함과 동시에 histone code를 인식해 결과적으로 recruit될 수 있게 됨.

 

 

 

다음 포스트에서는 heterochromatin과 histone methylation에 대해 알아보자.