[분자생물학] 11.4 : TFIIH의 구조와 기능 - 2

 

 

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어서 TFIIH의 구조와 기능에 대해 살펴보도록 하자.

 

 

 

우선 TFIIH의 helicase activity에 대해 알아보자.

 

 

 

 

위 그림에 나타나 있는 것은 TFIIH가 과연 helicase activity를 가지는지를 검증한 실험임.

 

 

보면 하나의 긴 DNA 가닥과 상호작용할 수 있는 짧은 DNA 가닥을 labeling한 채로 처리해줌. 그러면 위 그림 (a) 위쪽에 나타나 있는 것처럼 두 가닥의 DNA 사이에 hybrid가 형성될 것임.

 

 

이후 TFIIH, 그 중에서도 RAD25라는 subunit을 넣어줌. 이 때 만약 RAD25 부위에 helicase 활성이 있다면 앞서 형성된 hybrid는 해체되고 결과적으로 짧은 DNA 단일가닥만 남아 짧은 길이에 해당하는 부분에 band가 나타날 것임. 한편 RAD25 부위에 helicase 활성이 없다면 hybrid가 해체되지 않아 결과적으로 긴 길이에 해당하는 부분에 band가 나타날 것임.

 

 

 

실제 실험 결과가 (b)에 나타나 있음. 우선 lane 1의 경우 heat을 가해서 DNA hybrid를 인공적으로 분리시켜준 것인데, 보면 아래쪽에 band가 나타남. 한편 lane 2는 아무 protein도 가해주지 않은 것으로, 위쪽에 band가 나타남. lane 3에는 RAD25는 넣어줬지만 ATP는 넣어주지 않았는데, 이 경우 2와 동일한 결과가 나타남.

 

그런데 lane 4, 5에 걸쳐 점차 RAD25의 농도를 높아지도록 setting한 후 ATP를 넣어주게 되니 lane 1에서 관찰되었었던 아래쪽 band와 동일한 위치에서 점차 진한 band가 나타나기 시작함. 이를 통해 TFIIH의 RAD25 subunit이 helicase 활성을 가지고, 이 활성은 ATP가 있을 때만 가질 수 있다는 결론을 내릴 수 있음.

 

 

 

 

그런데 이 결과로 TFIIH가 helicase 활성을 가진다는 사실은 알 수 있지만, 이 helicase 활성이 과연 전사에 필수적인지는 알지 못함. (그냥 이런 활성을 우연히 가질 뿐 전사에는 아무런 도움을 주지 못할 수도 있음) 그러므로 이에 대해 확인하기 위해 추가적으로 실험을 수행하였고, 그 결과가 아래와 같음.

 

 

 

 

이 실험은 RAD25를 encoding하는 gene에 temperature-sensitive mutation을 일으켜서 만든 rad25-ts24 mutant에서 정상적인 전사가 일어나는지 여부를 확인한것임. 그런데 확인 결과 정상 RAD25에서는 incubation time이 늘어날수록 전사가 점점 더 많이 일어났지만 mutant에서는 전사가 잘 일어나지 않음. 그나마도 22도에서는 조금이나마 전사가 일어났지만 37도에서는 전사가 아예 일어나지 않음. 이를 통해 TFIIH의 helicase 활성이 전사에 있어서 꼭 필요하다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

그런데 이후 여러 실험들을 통해 TFIIE와 TFIIH가 open promoter complex 자체를 형성하는 데는 필수적이지 않다는 것을 알게 됨. 그 대신 TFIIE와 TFIIH는 promoter clearance에 있어 핵심적으로 작용함. 이 때 promoter clearance란 promoter에 붙어있던 일부 전사인자들이 complex로부터 빠져나오는 현상으로, 이 것이 일어나야 본격적으로 transcription elongation이 일어날 수 있음.

 

 

그런데 TFIIH가 open promoter complex의 형성에 필수적이지 않다면 TFIIH의 helicase 활성은 어디에 쓰이는 것일까. 결론적으로 TFIIH는 open promoter complex가 형성되면서 생긴 아주 좁은 melting site를 넓혀줘서 full melting이 일어날 수 있게 해줌. (이 full melting이 promoter clearance를 촉진하게 됨)

 

 

 

참고로 TFIIE, TFIIH는 본격적으로 elongation이 일어나게 되면 다 떨어져나감. (즉 elongation에서는 이들 둘이 전혀 기능하지 않음)

 

 

 

지금까지의 내용들을 알아보기 쉬운 모식도로 정리해보면 아래와 같음.

 

 

 

 

위 그림을 순서대로 하나하나 살펴보자. 우선 TBP, IIB, IIF, RNA polymerase II가 모여 minimal initiation complex를 형성하고, 그 결과 open promoter complex가 형성됨. (그림에는 나타나 있지 않지만 이 시기부터 DNA가 살짝 open됨)

 

 

이후 IIE와 IIH가 들어오게 되고 IIE, IIH가 이미 조금 open된 DNA 부분에 붙어 full melting이 일어날 수 있게 해줌. 한편 IIH는 ATP의 인산기를 가져와 CTD의 serine들을 인산화시켜줌. 이 시기가 되면 RNA polymerase II가 전사를 시작할 수 있으므로 짧은 전사체들이 생성되게 됨. 그러나 여러 전사인자들에 의해 +1 부위에서 RNA polymerase II가 더이상 나아가지 못하고 있으므로 앞으로 나아가지는 못하고, 결과적으로 짧은 전사체, 즉 abortive transcript만 생기게 됨.

 

 

 

그러다가 IIH, IIE에 의해 promoter clearance가 일어나게 되면 그제서야 비로소 RNA polymerase II가 본격적으로 나아가며 전사를 계속해가날 수 있게 됨. 이 과정에서 흥미롭게도 TEF(transcription elongation factor)b라는 녀석이 CTD domain에 더 많은 인산기를 붙여주게 됨.

 

 

 

참고로 마지막 과정에서 IIE, IIH가 떨어져나가게 되며, TBP, IIB는 elongation complex로부터는 떨어져나가지만 여전히 promoter 서열에는 붙어있게 됨. (이 상태로 다음 전사개시복합체의 형성을 기다리고 있음)

 

 

 

그런데 사실 TFIIH가 DNA의 unwind된 부분을 full melting시켜주는 것이 정말 helicase 활성에 의해 직접적으로 풀어주는건지, 단순히 DNA wrenching 활성을 바탕으로 다른 쪽에 supercoil을 만들어서 DNA를 간접적으로 풀어주는지에 대해서는 사실 논란이 많았음. 아직도 이 것이 분명하지는 않으나, 지금까지의 증거에 따르면 TFIIH가 가지는 molecular wrench 활성이 DNA bubble을 만드는 데 더 중요하게 작용할 것 같다고 여겨지고 있음.

 

 

 

넘어가기 전에 mediator에 대해 잠시 논해보자. 이 mediator에 대해서는 후에 훨씬 더 자세하게 다룰 기회가 있을 것임. 지금은 간단하게만 알아보자. mediator는 여러 protein들이 모여서 생성되며 이 녀석도 general transcription factor로 취급되고는 함. 그런데 mediator는 initiation에 꼭 필요하지 않으며, 단지 '활발한' 전사(activated transcription)가 일어나게끔 해주는 역할만 수행함.

 

 

 

 

 

다음 포스트에서는 진핵생물에서 일어나는 전사의 조절기작에 대해 알아보자.