[분자생물학] 4.1 : cloning (클로닝) - vector (벡터)

 

이번 포스트에서는 저번 포스트에 이어서 cloning을 위해 매우 중요한 요소 중 하나인 vector(벡터)에 대해 알아보도록 하자.

 

 

vector는 DNA carrier로 기능할 수 있는 녀석들을 통칭하는 용어이며 대표적인 vector로 plasmid, phage 등이 사용됨. 구체적으로 vector는 아래와 같은 조건을 만족해야 함.

 

 

 

 

1) origin of replication이 있어야 함. 

: 이 것이 있어야 재조합된 DNA를 계속 복제해낼 수 있을 것임. 

 

2) selectable marker(선별을 위한 마커)가 있어야 함. 

: 재조합이 잘 수행된 plasmid와 그렇지 않은 녀석들을 구분하기 위해서 (앞서 본 streptomycin 저항성과 같이) selectable marker가 필요함. 

 

3) multiple cloning site(MCS)가 필요함. 

: MCS는 우리가 인위적으로 (사용하기 쉽게) 밀집된 지역에 우리가 흔히 사용하는 제한효소들에 의해 잘리는 cut site들을 모두 밀집시켜 놓은 부분임. MCS가 있으면 바로 뒤에서 다시 살펴볼 directional cloning도 가능해짐. 

 

 

 

참고로 일반적인 vector는 무조건 promoter를 가질 필요는 없음. 단순히 cDNA를 다량 생산하는 것이 목적이라면 promoter는 필요하지 않음. 다만 특정 gene으로부터 유래한 RNA 혹은 protein을 살펴보려고 한다면 vector에 promoter가 있어야 함. 

 

 

 

 

지금부터 directional cloning에 대해 알아보자. 이 cloning은 MCS가 있는 vector에서 가능한데, 서로 다른 두 종류의 제한효소를 이용해 plasmid를 잘라줌. 그러면 plasmid 끝의 절단된 sticky end 종류가 서로 다를 것임. 한편 우리가 target으로 하는 gene이 포함된 DNA도 앞서 plasmid를 절단할 때 사용한 제한효소를 이용해 잘라준 후 plasmid에 삽입시켜주게 됨. 이 방법을 사용할 시 절대 self re-close가 일어날 수 없고 (sticky end가 다르므로) 또한 삽입되는 DNA의 방향도 우리가 원하는 하나의 방향으로만 넣어줄 수 있어 특정 유전자의 전사, 번역물을 보고자 할 때 매우 유용함.

 

 

 

지금부터 실제로 사용되는 대표적인 vector의 예시를 살펴보자.

 

 

 

위 그림은 pEGFP-C1이라는 vector를 보여주고 있음. 이 때 ori라 표시된 부분이 origin of replication, Kanr, Neor이라 표시된 부분이 (kanamycin, neomycin에 대해 저항성을 부여해주는) selectable marker, CMV라 표시된 부분이 promoter, MCS라 표시된 부분이 multiple cloning site임. 

 

 

 

 

다음으로 이 예시를 살펴보자. 이 vector는 pRSET-TriEX라는 녀석이며 이 녀석에도 아까와 마찬가지로 각종 vector의 요소들이 다 포함되어 있음.

 

 

 

한편 이 녀석의 MCS 서열을 나타낸 것이 위와 같음.

 

 

 

그렇다면 만약 우리가 실제로 와 같은 서열을 이 vector 사이에 끼워넣고 싶다면 어떻게 할 수 있을까.

 

 

이 때 2종류의 제한효소를 사용하므로 우리가 끼워넣기를 원하는 위 서열의 양쪽에도 제한효소에 의해 잘릴 수 있는 부위를 만들어 주어야 함. 이 때 또 고려해야할 사항이 있음. 만약 우리가 gene의 발현결과를 보고 싶다면 전사, 번역 과정에 대한 고려도 해야 함. 이 때 plasmid의 promoter 부위로부터 삽입되는 부위는 꽤나 떨어져 있음. 따라서 이 때 (b) 그림에서 3개씩 나눠놓은 순서에 맞게 gene이 삽입되어야 함. (즉, gene의 ATG 부위가 딱 (b) 그림에서의 3칸에 맞게 삽입되어야 함) 예를 들어 우리가 EcoRI을 앞쪽 절단효소로 쓰고자 할 때 EcoRI은 GAATTC를 인지하므로 추가적으로 GAATTC 부분을 gene의 앞에 붙여주고 제한효소를 이용하여 삽입해주게 되면 칸수가 맞지 않게 삽입됨. (GGA ATT CAT GCC ...) 이럴 경우 우리가 원하는 결과물이 합성되지 않을 수 있으므로 frame을 맞춰주기 위해 삽입하는 서열에 GAATTCXX와 같은 식으로 두 개의 임의의 nucleotide를 더 첨가해주어야 함.

 

 

 

 

 

다음으로, screening을 수행할 때 앞서 살펴본 것처럼 selectable marker가 필요함. 이 selectable marker로 가장 흔히 사용되는 것이 바로 antibiotic resistance gene들임. (대표적인 예로 앞서 살펴본 것과 같은 ampicillin resistance gene 등이 있음) 이 gene을 삽입해주면 bacteria 중 vector가 들어간 녀석만 선택적으로 배양할 수 있음. 

 

 

 

 

한편, 또 많이 사용되는 selectable marker가 바로 beta-galactosidase를 encoding하고 있는 lacZ라는 gene을 삽입해주는 방법임. 이 경우 특히 lacZ를 MCS 사이에 넣어주게 되는데, 이렇게 되면 재조합이 일어날 시 lacZ gene이 갈라져서 기능을 잃으므로, 표현형 관찰을 통해 우리가 원하는 gene에 대한 재조합 여부를 판단할 수 있음. 조금 더 구체적으로는 X-gal이라는 beta-galactosidase indicator를 넣은 media에 bacteria를 키웠을 때 lacZ가 정상적으로 발현된 경우에는 beta-galactosidase의 활성에 의해 X-gal이 절단되고, 그 결과 blue colony가 관찰됨. 한편 우리가 원하는 DNA의 재조합이 일어나서 lacZ가 정상적으로 발현되지 않은 경우 white colony가 관찰됨. (따라서 white colony만을 선택적으로 키우면 우리가 원하는 유전자가 재조합된 bacteria만을 선별적으로 키울 수 있음)

 

 

 

 

 

다음으로, plasmid 대신 phage(bacteriophage)를 vector로 사용해줄 수도 있는데, phage를 vector로 사용하는 시도는 실험실에서는 거의 잘 이루어지지 않고 기업 수준에서 많이 이루어지고 있음. (대부분 genomic library를 제작하는 용도로 많이 사용됨) 이 녀석을 vector로 사용했을 때의 장점은 비교적 긴 서열(20kbp정도)을 삽입할 수 있다는 것임. (plasmid를 사용할 경우 일반적으로 3~5kbp정도 이상을 삽입하기 힘듦) 이 경우에는 앞서의 plasmid transformation과는 다르게 clone이 colony 형태로 관찰되지 않고, 그 대신 (phage가 bacteria를 뚫고 나오므로) plaque(플라크)가 관찰됨. 

 

 

 

phage DNA는 맨 끝에 cohesive end(cos, 일종의 sticky end)를 가지고 있음. 한편 이 녀석의 유전체 중간 부분을 EcoR1으로 잘라준 후 그곳에 우리가 원하는 서열을 넣어주게 되면 삽입이 완료됨. 이 때 오른쪽 그림에서도 나타나 있듯 이 녀석들은 packaging을 통해 assemble되므로, DNA 서열의 길이가 달라지면 assemble이 제대로 일어나지 않음. 따라서 일반적으로는 제거해준 서열의 길이와 유사한 길이만큼의 DNA를 삽입해주어야 packaging이 잘 이루어짐.

 

 

plasmid, phage 이외에 cosmid, M13 phage vector, phagemids, eukaryotic vector 등을 vector로 사용할 수도 있음. 이 때 이름을 보면 유추할 수 있듯 cosmid, phagemid와 같은 녀석들은 plasmid와 phage의 성질을 동시에 가지도록 혼합한 형태임. (cosmid는 phage의 cos site와 plasmid의 origin of replication을 같이 가지고 있음) 한편, eukaryotic vector의 경우 eukaryotic cell에 cloning gene을 넣어줄 때 많이 사용함. 대표적인 예로 plant cell에 많이 사용되는 Ti plasmid가 있으며, 후에 다시 살펴볼 것임. Ti plasmid 이외에 yeast artificial chromosomes(YAC), bacterial artificial chromosome(BAC)과 같은 녀석들도 거대한 DNA 조각을 cloning할 때 많이 사용됨.

 

 

 

 

다음 포스트에서는 클로닝의 활용 방안 중 하나인 genomic library에 대해 알아보고, 이어서 cDNA cloning에 대해 알아보도록 하자.