놀면서 공부하기

면역침강(Immunoprecipitation, IP) 실험은 겉보기에는 간단해 보여도, 실제로는 수많은 변수에 따라 결과가 좌우돼요. 그중에서도 버퍼 조성은 단백질의 구조를 보존하고 항체와 항원의 결합을 유지하는 데 결정적인 역할을 해요. 버퍼가 적절하지 않으면, 타깃 단백질이 변성되거나 결합력이 약해져 IP 결과가 부정확하게 나올 수 있죠.실험 목적에 따라 버퍼를 비변성(non-denaturing), 변성(denaturing), 또는 무계면활성제(detergent-free) 형태로 선택할 수 있어요. 예를 들어, 세포질 단백질을 native 상태로 분리하려면 NP-40이나 Triton X-100 같은 비이온성 계면활성제가 포함된 버퍼를 사용하는 게 일반적이에요. 반면, 핵 안에 있는 단백질처..

면역침강(Immunoprecipitation, IP)은 단백질 하나를 분리해서 정성, 정량적으로 분석하는 데에 매우 유용한 실험이에요. 그런데 이 기본 IP에서 출발해, 단백질 간 상호작용이나 DNA, RNA와의 결합 여부까지 밝혀주는 다양한 응용 기법이 발전했어요. 오늘은 그중에서도 Co-IP, ChIP, RIP 세 가지를 비교해서 설명드릴게요.Co-Immunoprecipitation(Co-IP)Co-IP는 단순히 한 단백질을 뽑아내는 것이 아니라, 그 단백질과 상호작용하는 다른 단백질들도 함께 당겨오는 방법이에요. 예를 들어 A 단백질을 타깃으로 IP를 수행하면, A와 복합체를 이루고 있는 B, C 단백질도 함께 포획돼요. 이를 통해 단백질 간 상호작용 네트워크를 밝힐 수 있죠.이 방식은 신호..

면역침강(IP) 실험에서 비드에 항체를 어떻게 붙이느냐는 아주 중요한 요소예요. 항체가 잘 고정돼야 표적 단백질을 효과적으로 당겨올 수 있고, 불필요한 배경 신호를 줄일 수 있어요. 이번 글에서는 Protein A/G, 스트렙타비딘-바이오틴 시스템, 그리고 직접 고정(covalent crosslinking) 방식까지, 주요한 항체 고정 전략들을 비교해서 설명드릴게요.Protein A/G 기반 항체 고정 방식 가장 많이 사용되는 고정 방식은 Protein A, G, 또는 A/G를 활용하는 방법이에요. 이들은 항체의 Fc 영역에 결합하는 단백질로, 비드에 부착된 상태에서 항체를 포착하고, 항체는 다시 표적 단백질에 결합해요. 이 방식은 간편하고 상용화된 키트도 많아 가장 보편적으로 쓰여요.다만 단점도..

면역침강(IP) 실험에서 항체-단백질 복합체를 붙잡는 데 사용하는 비드는 실험의 핵심 재료 중 하나예요. 현재 가장 널리 쓰이는 비드는 아가로스 비드와 자성 비드(magnetic beads)인데요, 두 가지는 생김새부터 처리 방식, 실험 효율까지 꽤 큰 차이를 보여요. 이번 글에서는 두 비드의 차이점과 각각의 장단점에 대해 알아볼게요.아가로스 비드의 특징 아가로스 비드는 반투명하고 크기가 큰 스폰지 같은 구조예요. 일반적으로 원심분리로 가라앉히며 사용해요. 내부가 다공성이라 항체를 많이 결합할 수 있는 장점이 있어요. 하지만 이 구조 때문에 항체에 접근하기 어려운 경우도 있고, 원심분리 과정에서 손실이 생기기 쉬워요. 또한 여러 번의 세척 과정에서 비드를 건드리지 않고 상층액만 빼내는 것이 어려..

면역침강법(또는 Immunoprecipitation, IP)은 세포 내에서 특정 단백질을 선택적으로 분리해내는 실험 기법이에요. 실험실에서 흔히 사용되는 웨스턴 블롯(Western blot)이나 단백질 정량 전에, 관심 있는 단백질만을 골라내 분석을 쉽게 해주는 중요한 준비 단계라고 할 수 있죠. 이 기술은 항체가 가지고 있는 특이적인 결합 능력을 활용해서, 복잡한 세포 용해물 안에서 표적 단백질과 그 단백질이 결합한 복합체들을 분리해낼 수 있어요. 기존에는 크로마토그래피 컬럼을 이용해 시료를 여러 번 흘려보내며 분리했지만, IP는 소량의 비드(bead)를 마이크로튜브에 담고 배치(batch) 방식으로 진행돼요. 이로 인해 실험이 간편하고 시간도 절약할 수 있죠. 면역침강법의 기본적인 절차기본적으..

세포 안에서는 전사인자, 히스톤, 다양한 조절 단백질들이 DNA와 직접 결합하며 유전자 발현을 조절해요. 그런데 과연 어떤 단백질이 어느 DNA 부위에 결합하는지는 어떻게 알 수 있을까요? 바로 이걸 알아내는 실험이 Chromatin Immunoprecipitation, 줄여서 ChIP이에요. 그리고 이 ChIP을 차세대 시퀀싱 기술과 결합한 것이 바로 ChIP-seq이죠.ChIP이란 무엇인가요? ChIP은 세포나 조직에서 단백질과 DNA가 결합된 상태를 포르말데하이드로 고정한 뒤, 이 크로마틴을 잘게 쪼개고 특정 단백질에 특이적인 항체로 이 결합된 DNA 조각들을 뽑아내는 과정이에요. 이후 이 DNA 조각들을 분석함으로써 해당 단백질이 어디에 결합했는지를 알아낼 수 있어요. 초기에는 PCR로 개..

실험실에서 DNA나 RNA를 정량할 때, 나노드롭(NanoDrop)은 정말 유용한 장비예요. 단 1μL만 있으면 농도와 순도를 빠르게 확인할 수 있고, 별도의 시약이 들지 않아 경제적이기도 해요. 하지만 아무렇게나 사용하면 부정확한 데이터가 나오기 쉬운데요, 오늘은 나노드롭을 제대로 사용하는 8가지 팁을 소개할게요.1. 측정 전 반드시 클리닝하세요나노드롭의 정확도를 높이기 위해선 사용 전후로 펠티어 표면을 꼭 닦아야 해요. 2μL의 멸균수나 증류수를 아래쪽 금속 표면에 떨어뜨린 뒤, 상단 암을 닫고 1분간 기다려요. 그 후 먼지 없는 티슈로 닦아내면 돼요.2. 블랭크 측정도 꼭 확인하세요기기를 블랭킹한 다음, 같은 물질로 한 번 더 측정해 보는 게 좋아요. 이상한 피크가 보이면 다시 클리닝하고 ..

SAM 파일의 가장 앞부분에는 @ 기호로 시작하는 라인들이 있어요. 이 라인들이 바로 Header, 즉 헤더 정보예요. 헤더는 read 데이터가 아니라, 이 파일이 어떤 기준으로 만들어졌는지, 어떤 reference를 썼는지, 어떤 도구로 분석했는지를 설명하는 일종의 메타데이터예요. 대표적인 헤더 형식은 다음과 같아요 @SQ사용된 reference sequence에 대한 정보. 예 : @SQ SN:chr1 LN:248956422여기서 SN은 염색체 이름, LN은 해당 염색체의 길이를 의미해요.@PG어떤 프로그램으로 이 정렬을 수행했는지를 나타냅니다.예 : @PG ID:bwa PN:bwa VN:0.7.17 CL:bwa mem hg38.fa reads.fq 여기서 ID는 프로그램 ID, PN은 프로그램 이..

SAM이나 BAM 파일을 보면 각 read마다 정수 하나가 포함돼 있어요. 이것이 바로 FLAG 값인데요, 이 숫자 하나에는 해당 read가 어떤 방향으로 정렬됐는지, 짝을 이루는 mate read가 있는지, 품질 검사에서 탈락했는지 등의 다양한 정보를 담고 있어요. FLAG 값은 2진수 비트 조합으로 구성돼요. 예를 들어 FLAG 값이 99라면, 2진수로는 1100011이 되고, 이 안에는 다음 정보가 포함돼 있어요 이 read는 쌍으로 존재함 (1)제대로 짝지어 정렬됨 (2)이 read는 pair 중 첫 번째 read임 (64)그 짝은 반대 방향으로 정렬됨 (32) 이렇게 다양한 정보를 하나의 숫자로 요약할 수 있다는 점이 FLAG의 장점이에요. 특히 paired-end read 분석에서 매우 중..

BAM 파일은 SAM 파일을 바이너리 형식으로 압축한 것으로, NGS 데이터를 효율적으로 저장하고 분석하는 데 널리 사용돼요. 그런데 이렇게 생성된 BAM 파일은 대개 ‘정렬되지 않은 상태’로 시작해요. 정렬이란 각 읽은(read) 서열이 유전체 상에서 위치하는 순서대로 재배열하는 과정을 말하는데요, 대부분의 유전체 분석 도구는 BAM 파일이 좌표 기반으로 정렬되어 있어야 작동하므로 이 작업은 필수예요. 정렬을 위해서는 주로 Samtools나 Picard 같은 프로그램을 사용해요. 정렬 방식은 크게 두 가지인데요. 하나는 read 이름(ID)을 기준으로 하는 방법이고, 다른 하나는 유전체 상의 위치(좌표)를 기준으로 하는 방식이에요. RNA-Seq이나 DNA-Seq 분석에서는 좌표 기준 정렬이 대부분..