[분자생물학] 4.1 : cloning (클로닝) - restriction enzyme (제한효소)

 

이번 포스트에서는 분자생물학 연구에 있어 필수적인 실험 기법인 cloning(클로닝)에 대해 알아보도록 하자.

 

 

gene cloning은 분자생물학에 있어 매우 중요한 기술 중 하나인데, 특히나 과학자들이 특정 gene에 관심이 있을 때 이 gene을 엄청나게 많이 만들어내고자 하는 경우 gene cloning을 많이 사용함.

 

 

이 때 gene cloning에서는 일반적으로 eukaryotic gene을 작은 bacterial or phage DNA에 삽입한 후 이를 다시 bacterial host에 넣는 방식의 실험을 많이 수행함.

 

 

restriction endonuclease (제한효소)

 

restriction endonuclease는 1960년대 후반에 E. coli에서 처음 발견되었음. (E. coli는 이 효소를 자신의 DNA가 아닌 외래 DNA를 제거하는 용도로 일반적으로 많이 사용함) 이 때 이름에서도 알 수 있듯 이 효소는 특정 DNA 서열을 인지한 후 중간부분을 잘라버림. (즉, 이들은 일종의 분자 가위로 작용하여 외 DNA의 특정 부분을 잘라버림)

 

 

 

 

restriction endonuclease에는 위와 같은 종류들이 있는데, 위 표에서도 나타나 있듯 효소의 종류에 따라 다양한 서열을 인지하고 잘라줌. 이 때 이들은 종류에 따라 4bp 길이의 서열을 인지할수도, 6bp 길이의 서열을 인지할수도, 8bp 길이의 서열을 인지할수도 있음. (이 때 더 긴 서열을 인지하면 할수록 frequency of cut은 당연히 떨어짐. 이는 인지하는 길이가 길어지면 길어질수록 더 specific해지기 때문임) 한편 매우 중요한 것은 이들이 인지하는 서열이 모두 palindromic sequence(회문서열)라는 것임. (즉, 가운데를 기준으로 양 쪽 부분이 서로 상보적으로 대칭적임)

 

 

 

한편 restriction endonuclease의 종류에 따라 잘리고 남은 부분의 모양은 위 그림과 같이 다양함. 하나하나 살펴보자. 우선 HindIII에 의해 절단된 부분은 5' 부분이 튀어나와 있으므로 5' protruding end라 불러줄 수 있음. 다음으로 PstI에 의해 절단된 부분은 3' 부분이 튀어나와 있으므로 3' protruding end라 불러줄 수 있음. 이 때 HindIII, PstI과 같은 녀석들에 의해 잘려 생기는 튀어나온 절단면을 sticky end라 부름.

 

한편 EcoRV와 같은 녀석에 의해 절단된 부분은 끝 부분이 뭉툭함. 이런 절단면을 blunt end라 부름. 이런 blunt end는 이후 ligation 시 non-specific하게 결합하므로 생명공학적으로 잘 사용되지 않음.

 

 

 

그렇다면 이러한 restriction endonuclease들이 자신의 DNA를 자르지 않을 수 있는 원리는 무엇일까.

 

 

 

위 그림은 E.coli DNA에 존재하는 methylation site가 DNA 복제가 계속되더라도 methylase에 의해 methylation된 채로 유지되는 기작을 나타내고 있음. (주로 methylation이 A에 일어남) 이 때 restriction enzyme이 인식하는 부위 근방에 methylation이 되어 있으면 제한효소가 잘 자르지를 못함. 이러한 방식으로 host DNA의 절단을 억제하는 것임. 이러한 self-DNA cut 억제 system을 restriction-modification system이라 부름.

 

 

 

 

Boyer와 Cohen은 EcoRI이라는 제한효소를 이용하여 아래와 같이 2개의 plasmid를 절단한 후 이들을 ligase를 이용해 다시 재조합시켜 숙주에 주입해 봤음. (물론 이 실험은 각각의 plasmid가 오로지 한 개만의 EcoRI site를 가지고 있었기에 가능했음)

 

 

당연히 두 plasmid 다 EcoRI에 의해 절단되었으므로 sticky end는 서로 같을 것임. 그렇기에 위 그림과 같이 두 plasmid 조각이 재조합되는 것이 가능함. (이 때 보라색 plasmid의 경우 Tetracycline에 대해 저항성을 부여하는 gene을 포함하고 있고 노란색 plasmid의 경우 Streptomycin에 대해 저항성을 부여하는 gene을 포함하고 있음) 그런데 당연히 self re-close(재조합되지 않고 스스로 다시 붙는 경우)도 가능하기 때문에, recombinant DNA만을 얻기 위해 Tetracycline, Streptomycin이 모두 든 배지에서 이들을 배양함. 이 때 여기에서 살아남는 숙주 내부에 존재하는 plasmid가 바로 recombinant plasmid일 것임.

 

 

 

 

한편 위 그림과 같이 BamHI으로 하나의 plasmid를 잘라준 후, BamH1을 이용해 우리가 원하는 gene 부위가 포함된 DNA를 잘라주게 되면 sticky end가 동일하므로 앞서 잘라준 plasmid와 재조합이 가능해짐. (물론 위 그림과 같이 self re-close가 일어나 버릴 수도 있음. 위 그림에서는 이를 방지하기 위해 alkaline phosphatase를 이용해 인산기를 제거해버리는 방식을 사용함. 실제로 alkaline phosphatase를 사용하면 self re-close는 일어나지 않음)

 

 

 

 

다음 포스트에서는 이어서 cloning에 있어 매우 중요한 또하나의 요소인 vector(벡터)에 대해 알아보도록 하자.