[AAV] 2편 : AAV 플라스미드의 핵심 구성 – RepCap과 전달 플라스미드

 

 

 

AAV 벡터를 제작하기 위해서는 총 세 가지 플라스미드가 필요해요. 

 

 

1편에서는 AAV 벡터가 왜 연구와 치료에 유용한지를 소개했는데요, 이번 편에서는 그 벡터를 구성하는 핵심 플라스미드 2가지, 즉 RepCap 플라스미드와 전달 플라스미드(transfer plasmid)에 대해 자세히 알아볼게요.

 

RepCap 플라스미드란?

 

 

RepCap 플라스미드는 이름 그대로 replication(rep)과 capsid(cap) 유전자를 함께 담고 있는 플라스미드예요. 이 플라스미드는 바이러스가 스스로 복제하지 못하게 만든 rAAV 구조에서 '패키징 역할'을 대신해주는 플라스미드죠.

 

Rep 유전자는 총 4가지 단백질(Rep78, Rep68, Rep52, Rep40)을 만들어내요. 이 단백질들은 AAV DNA의 복제와 캡시드 안으로의 유전자 삽입에 중요한 역할을 해요. 특히 Rep78/68은 ITR에 결합해서 유전자 복제를 시작하고, Rep52/40은 복제된 유전자를 캡시드 안으로 '펌핑'해 넣어요.

 

Cap 유전자는 AAV 캡시드를 형성하는 VP1, VP2, VP3 단백질을 만들어내요. 이 세 단백질은 보통 1:1:10 비율로 조합되어 정이십면체 모양의 바이러스 껍질을 만들어요. 바로 이 껍질이 바이러스의 세포 감염 특이성(serotype)을 결정해요. 다양한 serotype을 활용해서 특정 조직이나 세포에만 감염되는 맞춤형 AAV를 만들 수 있어요.

 

 

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전달 플라스미드(transfer plasmid)란?

 

전달 플라스미드는 AAV 벡터에서 실제로 세포에 전달할 유전자를 담고 있는 플라스미드예요. 이 플라스미드에는 두 개의 ITR(Inverted Terminal Repeat)이 양 끝에 존재하고, 그 사이에 원하는 유전자를 넣어요. 이 ITR이 있어야만 rAAV로 패키징이 가능해요.

 

 

 

보통 ITR 사이에는 다음과 같은 구성 요소들이 들어가요

프로모터(promoter)

유전자의 발현을 조절해요. CAG, hSyn, EF1α 등 목적에 따라 선택할 수 있어요.

트랜스유전자(transgene)

우리가 세포에 전달하고자 하는 유전자예요. 예를 들어 GFP 같은 리포터, SaCas9 같은 효소, CRISPR gRNA 등 다양하게 들어갈 수 있어요.

WPRE

mRNA의 안정성과 번역 효율을 높여주는 후처리 요소예요.

polyA 시그널

mRNA의 끝을 안정화시키는 역할을 해요.

 

선택적으로 넣을 수 있는 구성도 있어요

 

AAV는 조건부 발현도 가능해요. 예를 들어 Cre-lox 시스템을 통해 특정 세포에서만 유전자가 발현되도록 조절할 수 있죠. 이때는 ITR 사이에 loxP 서열을 넣어서 Cre 효소가 존재할 때만 유전자가 활성화되게 설계할 수 있어요. 이런 구조를 FLEX 혹은 DIO 플라스미드라고 부르기도 해요.

 

ITR 보존에 주의

 

 

 

ITR은 AAV 패키징에 꼭 필요하지만, 불안정한 서열이에요. 반복적이고 GC-rich한 구조라서 일반적인 박테리아에서는 종종 재조합이 일어나 손실될 수 있어요. 

 

 

그래서 AAV 전달 플라스미드는 Stbl3처럼 재조합에 강한 세균에서 증식시키는 게 좋아요. SmaI 같은 제한효소로 ITR 보존 여부를 확인하기도 하고요.

 

 

RepCap과 전달 플라스미드는 AAV 벡터 제작의 핵심이에요. 각각의 유전자 구조와 기능을 이해하면, 실험 목적에 맞는 AAV 디자인이 가능해져요. 세포 특이성을 조절하거나, 발현 수준을 조절하거나, 조건부 발현까지도 가능하죠.

 

다음 편에서는 이 플라스미드들을 실제로 어떻게 조합해서 AAV를 생산하는지, 실험실에서의 “helper-free AAV 생산 시스템”을 중심으로 소개해드릴게요.