[분자생물학] 11.1 : 진핵생물의 보편전사인자(general transcription factor)

 

 

이번 글부터는 진핵생물이 가지는 general transcription factor(보편전사인자)에 대해 알아보도록 하자.

 

 

prokaryote에서는 RNA polymerase 그 자체가 아무 도움 없이 일단 붙는 것은 가능했다면, eukaryote에서는 RNA polymerase가 붙는 데에도 반드시 다른 단백질들의 도움이 필요함. 이 때 도움을 주는 녀석들이 바로 transcription factor임.

 

 

transcription factor는 크게 2가지 class로 나뉘어지는데, general transcription factor와 gene-specific transcription factor(activator)가 바로 그것임. 이 중 본 chapter에서는 general transcription factor에 대해 먼저 알아보자.

 

 

 

우선 class II promoter에 작용하는 class II factor들에 대해 먼저 알아보자. 이들은 RNA polymerase와 결합해서 preinitiation complex를 형성함. 이 때 preinitiation complex란 전사를 시작할 수 있는 complex를 의미함. (사실상 이 complex는 nucleotide만 있으면 바로 전사를 시작할 수 있는 형태임)

 

 

이 때 preinitiation complex가 DNA와 binding할 때 class II factor와 RNA polymerase는 전사 시작 부위에 해당하는 이중가닥 DNA를 open시켜 single strand로 만들어 open promoter complex를 형성시킴. (single strand DNA여야 RNA polymerase가 전사를 시작할 수 있기 때문)

 

 

 

class II preinitiation complex는 RNA polymerase II와 6개의 general transcription factor들(TFIIA, TFIIB, TFIID, TFIIF, TFIIE, TFIIH)로 구성되어 있음.

 

이 때 각각의 구성요소들은 특정 order를 바탕으로 순서대로 결합함.

 

 

 

이들의 결합순서를 밝힌 실험 결과가 위에 나타나 있음.

 

 

이 때 사용한 실험 기법은 gel mobility shift assay로, 특정 protein이 DNA와 붙을 시 무게가 무거워져서 gel 상에서 더 못 가라앉게 되고, 상대적으로 위쪽으로 shift되는 현상을 이용하게 됨. (참고로 이 때 labeling하는 대상은 DNA임)

 

 

우선 (a)부터 살펴보자. 이 때 gel의 맨 아래쪽에 나타난 band가 단백질과 붙지 않은 DNA에 해당하는 band임. 우선 TFIID와 TFIIA를 같이 넣어준 경우 DNA에 TFIID, TFIIA가 붙어서 shift가 일어났음을 알 수 있음. 한편, TFIID, A, B를 같이 넣어준 경우 TFIID, A만 넣어줬을 때에 비해 더 위쪽으로 shift된 band가 관찰됨.

 

 

4, 5, 6, 7 lane은 TFIID, A, B, F를 넣어준 후 4, 5, 6, 7으로 갈수록 점점 많은 양의 RNA polymerase II를 넣어준 결과임. 보면 RNA polymerase II가 적을 때는 DAB에서와 거의 비슷한 위치에서 band가 나오다가 RNA polymerase II가 점차 많아짐에 따라 더 많이 shift된 band가 생김.

 

이를 통해 (특히 4번을 통해) TFIIF는 독자적으로는 DNA와 결합하지 못한다는 것을 알 수 있음. 한편 8, 9, 10, 11 lane의 경우 TFIID, A, B, RNA polymerase II를 넣어준 후 8, 9, 10, 11로 갈수록 점점 적은 양의 TFIIF를 넣어줘봤음. 그랬더니 band의 양상이 RNA polymerase II를 점차 많이 넣어줬을 때와 동일하게 나타남. 이를 통해 TFIIF와 RNA polymerase II가 서로 같이 존재해야만 DNA와 binding할 수 있다는 것을 알 수 있음.

 

 

다음으로 13 lane을 살펴보자. 이 경우 TFIID만 빼고 나머지 전부를 넣어줬을 때의 결과임. 보면 DNA와 단백질 간의 binding이 전혀 이루어지지 않았음을 알 수 있음. 이를 통해 TFIID가 가장 먼저 DNA에 붙으며, TFIID가 없으면 나머지 녀석들도 DNA에 붙지 못한다는 것을 알 수 있음.

 

 

그 다음으로 14 lane을 살펴보자. 이 경우 TFIIB만 빼고 나머지 전부를 넣어줬을 때의 결과임. 보면 DA 부근에 해당하는 shift는 나타났으므로 DNA에 TFIID, TFIIA는 붙었지만 TFIIF, RNA polymerase II 등은 붙지 않았음을 알 수 있음. 따라서 TFIIB는 TFIID 이후에 붙으며 TFIIF, RNA polymerase II 등의 결합을 매개하는 역할을 한다는 것을 알 수 있음.

 

 

마지막으로 15 lane을 살펴보자. 이 경우 TFIIA만 빼고 나머지 전부를 넣어줬을 때의 결과임. 보면 DBPolF에 해당하는 band가 나타난 것을 알 수 있음. 즉, TFIIA는 전체 preinitiation complex를 만드는 데 있어 직접적인 공헌을 하지는 않는다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

다음으로 (b)를 살펴보자. 이번에는 TFIID, B, F, RNA polymerase II는 다 넣어준 상태에서 E, H와 관련된 gel mobility shift assay를 수행함.

 

 

lane 1은 TFIID, B, F, RNA polymerase II만 넣어줬을 때의 결과임. 한편 lane 2는 추가적으로 TFIIE를 넣어줬을 때의 결과인데, 보면 1에 비해 추가적인 shift가 일어났음을 알 수 있음. 그리고 lane 3와 같이 TFIIE, H를 다 넣어준 경우 1, 2보다 더 많이 shift가 일어났음을 알 수 있음. 한편 4, 5, 6, 7을 보면 TFIIE, H는 넣어준 상태에서 RNA polymerase II, TFIIF, TFIIB, TFIID를 하나씩 빼 봤을 때 shift band가 거의 나타나지 않음을 알 수 있음. (TFIIE, H만으로는 따로 complex를 이루지 못함) 즉, 이들은 TFIID, B, F, RNA polymerase II가 다 조립된 상태가 되어야 비로소 붙는 녀석들임.

 

 

정리하자면 TFIID가 가장 먼저 들어오고, 이후 TFIIB가 들어온 후 RNA polymerase II와 TFIIF가 동시에 들어오고, 그 다음 순서대로 TFIIE와 TFIIH가 들어옴. (TFIIA는 적어도 complex를 이루는 데 있어서는 필수적인 역할을 수행하지 않는 것으로 보여짐)

 

 

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한편 지금까지 언급했던 preinitiation complex를 이루는 각종 general transcription factor들이 구체적으로 DNA의 어디에 붙는지를 알아보기 위해 footprinting을 진행함.

 

 

이 때 footprinting 시 사용되는 DNA 절단 방식으로 DNase I을 사용하는 것과 OP-Cu2+를 사용하는 것이 있음. 아래에는 이 중 DNase I을 사용하는 방식에 대한 모식도가 나타나 있음.

 

 

 

한편 OP-Cu2+는 DNase I과는 달리 매우 작은 크기를 가지고 있으며, 이 녀석은 hydroxy-radical을 생성함. 이 때 radical은 매우 불안정하므로 DNA와 반응하게 되고, 그 결과 DNA가 분해됨.

 

 

이 때 DNase I을 쓰는 것과 OP-Cu2+를 쓰는 방법에는 각각 장단점이 있음. 우선 OP-Cu2+의 장점에 대해 알아보자. DNase I의 경우 어느 정도의 크기를 가진 단백질이고, 이 녀석이 DNA를 절단하기 위해서는 일단 DNA에 가서 달라붙어야 함.

 

 

 

이 때 위 그림과 같이 DNase I(빨강) 자체의 부피가 있으므로 결과적으로 footprinting 결과는 원래 단백질의 binding site보다 양쪽으로 더 넓어진(형광색) 형태로 나타나게 됨. (DNase I이 붙어있는 부분에도 DNA 절단이 일어나지 않을 것이므로) 한편 OP-Cu2+의 경우 DNase보다 훨씬 크기가 작으므로 조금 더 단백질 자체의 binding region만을 정확히 footprinting할 수 있음.

 

 

 

물론 DNase I도 장점이 있는데, 어쨌거나 DNase I은 위 그림과 같이 특정 단백질 결합부위가 있기만 하면 자신의 부피까지 포함해서 footprint를 찍어내기는 하는데, OP-Cu2+의 경우 만약 단백질과 DNA 사이 결합부위가 너무 좁다면 OP-Cu2+가 붙어있어도 별로 티가 나지 않고 footprint가 안 나타나버릴 수도 있음.

 

 

이러한 장단점이 있기 때문에 일반적으로 DNase I과 OP-Cu2+를 같이 사용해서 실험 결과를 많이 도출함.

 

 

 

 

위 그림은 footprinting 실험 결과임. 우선 template DNA strand를 대상으로 수행한 footprinting 결과인 (a)를 살펴보자. 보면 OP-Cu2+를 사용한 경우 DA, DAB를 넣었을 때 확연한 단백질 결합 부위가 관찰됨을 알 수 있음. 특히 이 단백질 결합 부위가 TATA box라는 사실 또한 알 수 있음. 그런데 이 때 DA와 DAB를 넣었을 때 footprint 크기의 차이가 거의 없음. 이는 TFIIB가 DNA 자체와 결합하는 면적은 거의 없다는 것을 의미함.

 

 

한편 DNase I을 사용한 경우 DA와 DAB를 넣어주었을 때 OP-Cu2+를 사용했을 때보다 조금 더 넓은 footprint가 관찰됨을 확인 가능함. (이는 앞서 이야기한 이유 때문임) 한편 OP-Cu2+를 사용했을 때는 TFIID만 넣었을 때 아무런 footprint가 나타나지 않은 반면 DNase I을 사용했을 때는 footprint가 나타남. 이 또한 앞서 말한 것처럼 DNase I이 OP-Cu2+보다 좁은 결합부위를 더 잘 나타내주기 때문에 나타난 현상임.

 

 

다음으로 nontemplate DNA strand를 대상으로 수행한 footprinting 결과인 (b)를 살펴보자. 보면 이 경우에도 (a)에서와 매우 유사한 pattern이 나타난다는 것을 알 수 있음.

 

 

한편 (b) 중 DNase I을 사용해서 얻은 data에서 DAB를 넣어주었을 때 오히려 band가 더 진해진 부분을 관찰 가능함. 즉, DNase I에 대해 hypersensitivity를 보임. (파란색 box로 mark되어 있는 부분) 이는 TFIIB가 들어오면서 DNA 구조 자체가 변형되고, 결국 DNase I에 대한 sensitivity가 더 높아져서 생기는 현상이라고 이해하면 됨.

 

 

 

 

정리하자면 TFIID는 맨 처음 DNA와 binding하며, TFIIA는 이후 binding하여 DNA와의 결합 넓이를 더 넓힘. 그런데 TFIIB의 경우 DNA와의 interaction에는 거의 관여하지 않음. (다만 앞서 본 것처럼 TFIIB가 들어오면서 DNA 구조 자체가 변해 DNase I에 대한 hypersensitivity가 관찰됨)

 

 

 

이후 동일한 footprinting 실험을 TFIID, A, B, F, RNA polymerase II를 다 넣은 상태에서 수행한 결과, 위 그림과 같이 DNA와의 binding 부위가 훨씬 넓어짐.

 

 

지금까지 얻은 실험 결과를 정리하면 아래와 같이 preinitiation complex 형성 과정의 모식도를 그릴 수 있음.

 

 

 

 

 

위 모식도를 보면 TFIIA는 DNA 부위에 붙기는 하지만 preinitiation complex가 형성되는 곳과는 반대쪽에 위치하고 있어서 직접적으로 complex 형성에 관여하지는 않고 있음을 알 수 있음. (특히 in vitro에서는 TFIIA가 없어도 preinitiation complex가 잘 형성되는 것을 보아 TFIIA가 optional한 것처럼 보임) 한편 TFIIB는 complex의 형성에는 관여하지만 DNA와 직접적으로 큰 면적으로 binding해서 DNA와의 binding region을 넓히지는 않고 있음을 알 수 있음. 또 앞서 본 것처럼 TFIIF와 RNA polymerase II는 같이 들어오고 있다는 것도 알 수 있음.

 

 

이 그림에는 나타나있지 않지만 이후 TFIIE, TFIIH가 순서대로 추가적으로 결합하게 되고, 그 결과 DABPolFEH가 다 결합하여 complete preinitiation complex를 이루게 됨.

 

 

 

 

다음 포스트에서는 본격적으로 TFIID의 구조와 기능에 대해 살펴보자.