[분자생물학] 18.2 : 번역 신장 (translation elongation) - 1st step

 

 

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어서 구체적으로 elongation의 첫 번째 단계에 대해 살펴보도록 하자.

 

 

 

앞서 살펴봤듯이 elongation의 첫 번째 step은 aminoacyl-tRNA가 ribosome의 A site에 결합되는 것임.

 

이 과정에서 EF-Tu, aminoacyl-tRNA, GTP가 합쳐져서 만들어지는 ternary complex가 생기게 됨. 그렇다면 이런 complex가 생긴다는 것은 어떻게 알게 되었을까.

 

 

 

 

 

 

위 그림은 labeling한 GTP, labeling한 Phe를 이용해서 수행한 gel filtration 결과를 보여주고 있음. 그 결과 fraction number 20 부근에 GTP, Phe-tRNA가 많이 관찰됨을 확인함. 물론 위 그림에는 나타나 있지 않지만 fraction 20 부근에 EF-Tu도 존재하고 있음. 즉, 이 실험 결과를 통해 어떤 식으로든 EF-Tu와 GTP, Phe-tRNA가 서로 모여 complex를 형성하고 있다는 사실을 알 수 있음.

 

 

 

그렇다면 complex를 이루는 각각의 녀석들은 구체적으로 어떤 역할을 수행하는 것일까. 이에 대해 실마리를 제공해줄 수 있는 실험결과가 아래에 제시되어 있음.

 

 

 

 

이 실험은 기본적으로 아무 것도 넣어주지 않았을 때, EF-T와 GTP를 넣어주었을 때, EF-T와 GDPCP(hydrolysis가 불가능한 GTP)를 넣어주었을 때 각각 ribosome 내에 존재하는 N-acetyl-phe-tRNA, N-acetyl-diPhe-tRNA, Phe-tRNA의 양이 어느정도인지를 확인한 것임. (이 때 N-acetyl-phe-tRNA는 ribosome과 이미 incubation을 통해 binding되어 있는 상태임. 즉, 새로운 Phe-tRNA가 결합하는 시점에 N-acetyl-Phe-tRNA는 P site에 위치하고 있음. 그리고 만약 새로운 Phe-tRNA가 A site로 들어온 후 P site의 N-acetyl-Phe과 서로 결합하게 되면 이 때 생성되는 결과물이 바로 N-acetyl-diPhe-tRNA임)

 

 

 

결과를 살펴보자. 우선 Phe-tRNA의 양을 먼저 주목해보자. 보면 아무 것도 넣어주지 않았을 때에 비해 EF-T와 GTP 혹은 EF-T와 GDPCP를 넣어주었을 때 훨씬 더 많은 Phe-tRNA가 ribosome과 결합한다는 것을 알 수 있음. 다만 이 경우 일반적인 GTP를 넣어줬을 때에 비해 GDPCP를 넣어주었을 때 Phe-tRNA의 값이 감소하지 않음. 이를 통해 EF-T와 GTP가 새로운 tRNA가 A site에 binding하는 것을 도와주는 역할을 하지만, 이 과정에서 GTP의 hydrolysis 여부는 중요하지 않다는 것을 알 수 있음.

 

 

다음으로 N-acetyl-diPhe-tRNA 생성 정도를 살펴보자. 이 정도는 결국 peptidyl transfer의 정도를 의미한다고 봐도 무방함. 결과를 보면 흥미롭게도 아무 것도 넣어주지 않았을 때에 비해 EF-T와 GTP를 넣어줬을 때 이 정도가 증가한 것에 더해, EF-T와 GDPCP를 넣어준 경우 다시 아무 것도 넣어주지 않았을 때와 비슷한 수준으로 peptidyl transfer의 정도가 감소함. 이를 통해 peptidyl transfer가 일어나는 과정에서도 EF-T와 GTP가 필요하고, 특히 이 과정에서는 GTP의 hydrolysis가 필요하다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

+) 참고로 위 자료 중 EF-T와 GTP를 넣어주었을 때 N-acetyl-Phe-tRNA의 양과 N-acetyl-diPhe-tRNA의 양을 합쳐보면 얼추 아무 것도 넣어주지 않았을 때의 N-acetyl-Phe-tRNA 양과 비슷하다는 것을 알 수 있음. 이는 당연한데, 아무 것도 넣어주지 않을 시 독립적으로만 P site에 존재하던 녀석이 EF-T, GTP의 도움을 받아 일부 peptidyl transfer에 의해 더 큰 peptide 덩어리를 만들게 되기 때문임.

 

 

 

 

한편 위 그림에 나타난 실험 결과를 보면 조금 더 많은 사실을 알 수 있음.

 

 

 

일단 (a)부터 살펴보자. 이 경우 EF-T를 넣어준 경우, 넣지 않은 경우 각각에 대해 GTP를 서서히 증가시켜가면서 Phe-tRNA이 ribosome에 binding되는 정도를 파악함. 그랬더니 EF-T가 있는 경우 GTP 증가에 따라 tRNA binding도 증가한 반면, EF-T가 없는 경우 아무런 변화가 없었음. 이를 통해 EF-T와 GTP가 다 있어야 비로소 tRNA와 ribosome이 결합하는 것이 가능해진다는 것을 알 수 있음.

 

 

다음으로 (b)를 살펴보자. 이 경우에는 EF-T와 EF-G가 다 있는 경우, EF-T만 있는 경우 각각에 대해 GTP 양을 점차 증가시켜가면서 phenyalanine polymerization이 얼마나 일어나는지(즉, FFFFFFFF...의 합성이 얼마나 잘 일어나는지) 정도를 파악함. 그 결과 EF-T와 함께 EF-G가 같이 있을 때만 GTP 증가에 따라 polymerization 정도가 증가함. 이를 통해 ribosome에 의한 peptide polymerization에는 EF-T 뿐만 아니라 EF-G도 필요하며, 이 과정에도 마찬가지로 GTP가 필요하다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

 

앞서 EF-Tu에 대해 주로 알아봤었는데, 사실 EF-T에는 EF-Tu와 EF-Ts의 두 종류가 있음. 그렇다면 이들 각각은 어떤 역할을 수행하는 것일까.

 

 

 

위 표에서는 아무 것도 넣어주지 않았을 때, EF-Ts와 GTP를 넣어줬을 때, EF-Tu와 GTP를 넣어줬을 때, EF-Ts, EF-Tu, GTP를 넣어줬을 때 Phe-tRNA가 ribosome에 binding되는 정도가 얼마인지가 나타나 있음. (이 실험에서도 N-acetyl-Phe-tRNA를 ribosome에 prebound시켜준 상태로 Phe-tRNA의 A site binding 정도를 측정함) 보면 EF-Ts를 넣어줬을 때는 거의 binding 정도가 변하지 않다가 EF-Tu를 넣어주면 binding되는 정도가 증가하고, EF-Tu, EF-Ts를 같이 넣어주면 binding되는 정도가 극대화된다는 것을 알 수 있음. 이를 통해 적어도 aminoacyl-tRNA의 binding에 Ts, Tu가 둘 다 어느 정도는 필요하며, 다만 EF-Ts가 조금 더 보조적인(혹은 간접적인) 역할을 수행하지 않을까 유추할 수 있음.

 

 

 

한편 EF-Tu-GTP가 ribosome에 붙게 되면 EF-Tu가 원래 가지고 있지만 inactivated되어 있었던 GTPase activity가 ribosome-dependent하게 activation되면서 GTP가 GDP로 바뀌게 됨. 뒤이어 EF-Tu-GDP는 ribosome으로부터 dissociate되게 됨.

 

 

그렇다면 도대체 EF-Ts는 어떤 역할을 하는 것일까. 결과적으로 말하자면 EF-Ts는 hydrolysis를 통해 release된 EF-Tu-GDP를 다시 EF-Tu-GTP로 바꿔주는 역할을 수행함. 이와 관련된 실험 결과가 아래와 같음.

 

 

 

 

 

 

보면 EF-Tu-GDP, EF-Tu-GTP, EF-Tu + GTP를 넣어준 각각의 case에서 EF-Ts가 있을 때, 없을 때에 대해 aa-tRNA-EF-Tu-GTP의 생성 정도를 파악함. 그 결과 (a)와 같이 EF-Tu-GDP를 넣어준 경우에는 EF-Ts를 넣어주지 않았을 때보다 넣어줬을 때 훨씬 더 aa-tRNA-EF-Tu-GTP의 생성량이 증가한다는 것을 알 수 있음. 즉, EF-Ts가 EF-Tu-GDP를 EF-Tu-GTP로 바꿔주고, 이렇게 만들어진 EF-Tu-GTP가 다시금 aa-tRNA와 결합하게 되는 것임.

 

 

한편 (b)나 (c)처럼 EF-Tu-GTP 혹은 EF-Tu+GTP(후자의 경우 결국 GTP가 있으므로 EF-Tu에 GTP가 charging되게 됨)를 넣어준 경우에는 EF-Ts가 있으나 없으나 결과가 비슷함. 이는 EF-Ts가 EF-Tu-GDP를 EF-Tu-GTP로 recharging시켜줄 필요가 없기 때문임. (이미 EF-Tu-GTP가 처음부터 있으므로)

 

 

 

 

 

위 그림에 나타난 실험 결과는 EF-Ts에 의한 효과를 더 dramatic하게 보여주고 있음. (a), (b), (c)로 갈수록 더 많은 양의 EF-Ts를 넣어줬으며, 이 때 빨간색은 GDP를, 파란색은 EF-Tu를 나타내주고 있음. gel filtration 결과를 보면 (a)에서처럼 적은 양의 EF-Ts를 넣어줬을 때는 EF-Tu와 결합된 GDP가 많이 존재하지만, (b), (c)로 갈수록 EF-Tu와 결합된 GDP가 현저히 적어지고 free GDP의 양이 늘어남. 이를 통해 EF-Ts가 EF-Tu-GDP에서 GDP를 분리시켜주는 역할을 수행한다는 것을 알 수 있음.

 

 

그렇다면 구체적으로 EF-Ts는 어떻게 이런 일을 할 수 있을까.

 

 

 

 

위 그림에 그 mechanism이 대략적으로나마 나타나 있음. 이 때 위 그림 가운데 부분에 GDP가 나타나 있으며, GDP 주변을 black line으로 표시된 EF-Tu가 둘러싸고 있음. 이 상태에서는 EF-Tu 중 일부 residue에 의해서 Mg가 coordinate되어 있고, 이 덕분에 Mg의 영향으로 GDP도 안정한 상태를 유지하고 있음. 그런데 EF-Ts가 존재하는 상황에서는 위 그림에서 red line으로 나타난 것처럼 EF-Tu가 변하게 되고, 그 과정에서 Mg를 coordination하고 있던 EF-Tu 내 일부 residue가 바깥쪽으로 틀어지게 됨. 그 결과 GDP가 불안정해지고 비교적 쉽게 떨어져나갈 수 있게 됨. (즉, GTP가 binding될 환경이 갖춰짐)

 

 

 

 

지금까지 살펴본 EF-Tu, EF-Ts의 역할, 작동 기전을 한 번에 나타낸 것이 위 그림임. 보면 EF-Tu가 tRNA binding, GTP hydrolysis에 중요하게 작용하고, EF-Ts는 다시금 EF-Tu에 GTP를 recharging시켜주는 역할을 한다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

 

 

한편 위 그림에도 나타나 있듯이 EF-Ts는 일종의 GEF(guanine nucleotide exchange factor)로 작용하고, ribosome dependent GTPase의 경우에는 GAP(GTPase activator protein)으로 작용한다는 것을 기억해두자.

 

 

 

그런데 protein 합도 일종의 polymerization이기 때문에 error가 발생할 수 있어서 proofreading 기작이 존재함.

 

 

 

 

기작은 매우 단순한데, 위 step에서 붉게 check된 두 step에서 머무는 시간이 상대적으로 길다 보니 codon과 anticodon 사이의 적절한 base pairing이 되어있지 않다면 peptide bond가 형성되기 전에 tRNA가 다시금 ribosome 밖으로 release되는 방식으로 작동함. (EF-Tu-GTP가 붙어 있을 때도, 떨어지고 나서도 부적합한 tRNA가 떨어져 나갈 수 있는 chance가 있음)

 

 

다만 위에서 check된 단계들이 매우 오래 지속된다면 fidelity는 증가할지 몰라도(즉, error rate는 낮아질지 몰라도) 단백질 합성의 효율은 감소함. (단백질 합성 효율이 감소하면 cell 내에서 단백질 합성에 의해 즉각적인 반응을 이끌어내기 어려울 것임) 즉, 지나치게 느리지도 않게, 그렇다고 너무 빠르지도 않게 본 step이 진행되는 것이 좋음. (다시 말해 speed와 accuracy가 균형을 맞추는 것이 좋음) 일반적으로 ~0.01%/1 amino acid 정도의 비율이 speed와 accuracy에 있어 좋은 balance error rate임.

 

 

 

 

 

한편 위 그림과 같이 인위적으로 charging되는 amino acid가 바뀌게 만들어줘도 tRNA의 anticodon이 똑같다면 fidelity는 그대로임. 즉, 다시 말해 ribosome은 tRNA의 anticodon 서열과 codon 서열간의 상보성만으로 적절한 tRNA가 들어왔는지, 그렇지 않은지를 판단함.

 

 

방금 살펴본 proofreading과 관련해서 흥미로운 항생제가 있음. 바로 streptomycin임. 이 항생제는 translation 과정에서의 proofreading을 방해하고, 그 결과 이상한 amino acid가 peptide bond 사이에 끼어들어가게 만들어버림. 이런 일이 일어나는 이유는 기본적으로 streptomycin이 30S subunit에 binding한 후 conformational change를 유발하기 때문임. 결과적으로 streptomycin은 30S subunit을 가지고 있는 원핵생물 system에만 작용하고, 그 결과 이상한 peptide들이 생성되어서 (error rate가 급상승해서) 원핵생물이 제대로 기능하지 못하게 함. 이런 mechanism을 가지고 있기에 streptomycin은 항생제로 많이 사용됨.