[FRET] 2편 : FRET 실험의 설계 및 주의사항

 

 

지난 글에서 FRET이 무엇인지, 어떤 원리로 작동하는지, 그리고 얼마나 가까운 거리의 상호작용을 감지할 수 있는지에 대해 살펴봤죠. 

 

 

이번엔 실제 실험을 진행할 때 어떤 점들을 고려해야 하는지에 대해 이야기해보려 해요. 아무리 멋진 기술이라도, 제대로 설계하지 않으면 원하는 결과를 얻기 어렵거든요.

 

어떤 형광 단백질을 쓸지부터 고민해요

 

 

FRET의 핵심은 도너와 액셉터 사이의 에너지 전달이에요. 그러니 두 형광 단백질의 스펙트럼이 적절히 겹쳐야 FRET이 일어나겠죠.

 

가장 많이 사용되는 조합 중 하나는 CFP (cyan fluorescent protein) – YFP (yellow fluorescent protein) 페어예요. CFP의 방출 스펙트럼이 YFP의 흡수 스펙트럼과 잘 겹치거든요.

 

하지만 요즘은 밝기, 안정성, 단일체 형태 등 여러 기준에서 더 우수한 형광 단백질들이 개발되고 있어요. 예를 들어 mTurquoise2, Venus, mCitrine, mNeonGreen, mScarlet 등의 조합이 많이 사용돼요.

 

 

여기서 중요한 건 단순히 색이 예쁜 걸 고르는 게 아니라,

도너가 충분히 밝고,

액셉터가 그 에너지를 잘 받아들이며,

둘 다 세포 안에서 안정적으로 발현되어야 한다는 거예요.

 

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인트라와 인터 FRET, 어떻게 다를까요?

 

 

FRET 실험은 크게 두 가지 유형으로 나눌 수 있어요.

Intramolecular FRET (분자 내 FRET)
하나의 단백질 안에 도너와 액셉터가 함께 붙어 있는 구조예요. 단백질이 어떤 신호를 받아 구조가 바뀔 때, 도너와 액셉터 사이의 거리가 가까워지거나 멀어지면서 FRET 신호가 변화해요.
대표적인 예가 FRET 기반 칼슘 센서 같은 거예요.

Intermolecular FRET (분자 간 FRET)
도너와 액셉터가 각각 다른 분자에 붙어 있어요. 이 두 분자가 세포 안에서 결합하거나 상호작용할 때 FRET이 발생하죠.
예를 들어 단백질 A에 도너를, 단백질 B에 액셉터를 붙여서 둘의 결합 여부를 보는 방식이에요.

 

실험 목적에 따라 어떤 방식이 더 적합할지는 다르니, 연구 질문을 명확히 하고 설계를 시작하는 게 좋아요.

 

FRET 측정은 어떻게 하나요?

보통 세포 이미징을 통해 측정하지만, 주의할 점이 많아요. 도너와 액셉터는 각각의 형광을 낼 수 있기 때문에, 단순히 액셉터 형광이 보인다고 해서 그게 다 FRET 때문은 아니에요.

그래서 아래와 같은 방법들을 많이 써요

 

FRET ratio 분석

 

도너와 액셉터의 형광 강도를 각각 측정해서 비율로 분석해요.

 

acceptor photobleaching

 

액셉터를 강한 빛으로 일부러 파괴한 후, 도너 형광이 얼마나 증가하는지 보는 방법이에요. 에너지를 뺏어가던 액셉터가 없어지면 도너 형광이 다시 강해지겠죠?

 

FLIM (fluorescence lifetime imaging microscopy)

 

도너의 형광 수명을 측정해서 에너지가 전달됐는지 정밀하게 파악하는 기술이에요. 장비가 좀 복잡하지만 정확도가 높아요.

 

주의해야 할 것들

 

발현 수준 조절

 

도너와 액셉터가 너무 많이 발현되면 인위적으로 가까워져서 FRET이 과장되게 보일 수 있어요. 세포 내 발현 수준을 가능한 한 생리적 조건에 맞춰야 해요.

단백질 기능 보존

 

형광 단백질을 단백질 앞이나 뒤에 붙이게 되는데, 그 위치에 따라 단백질의 기능이 영향을 받을 수 있어요. 때로는 단백질 사이에 짧은 링커 서열을 넣어줘야 FRET도 잘 일어나고 단백질 기능도 유지돼요.

배경 신호 조절

 

FRET이 아닌 단순한 형광 신호 간 누출(cross-talk)을 제거해줘야 해요. 컨트롤 실험을 꼼꼼히 설계해야 하는 이유죠.

 

 

FRET 실험은 단백질 간 거리, 상호작용, 구조 변화를 실시간으로 들여다볼 수 있는 아주 강력한 기술이에요.

 

 

 

물론 섬세하게 설계해야 하고, 신호 해석도 조심스럽게 접근해야 하지만, 잘 활용하면 눈에 보이지 않는 분자들의 ‘거리감’까지도 알아낼 수 있어요.