[유전학] 10.2 : DNA library, PCR

 

 

이번 포스트에서는 DNA library, PCR에 대해 알아보자.

 

 

DNA library는 특정한 조직, 세포, 또는 개체로부터 유래된 각각의 단일 source의 cloning된 DNA 전체 모음을 의미함. (그냥 전체 DNA를 mixture 형태로 함유하고 있기만 해도 이를 DNA library라고 함)

 

DNA library에는 genomic library가 포함됨. 이 때 genomic library는 우리가 관심을 가지고 있는 genome의 전체 sequence에 대해 적어도 1개의 copy를 가지고 있는 library를 의미함.

 

 

한편 DNA library에는 complementary DNA(cDNA) library도 포함됨. 이 때 cDNA library란 mRNA를 reverse transcriptase를 이용해 다시 DNA로 만들어 보관한 형태임.

 

reverse transcriptase는 RNA virus에서 발견되며, RNA virus가 bacteria에 침임해 RNA→DNA로 전환된 후 mRNA로 다시 전사되어 발현되는데, 이 때 RNA→DNA로 전환되는 과정에서 reverse transcriptase가 사용되게 됨. 그리고 이 때 reverse transcriptase는 error rate이 크다 보니 RNA virus는 다른 virus에 비해서도 훨씬 빠르게 mutation을 획득 가능함.

 

 

실제로는 RNA virus로부터 reverse transcriptase를 뽑고, 이를 error rate이 적게 만든 채로 cDNA를 만드는데 사용하게 됨.

 

 

 

 

위 그림에는 cDNA library를 만드는 과정이 나타나 있음.

 

 

우선 맨 처음으로는 mRNA의 3' 말단에 있는 poly A tail과 상보적으로 결합할 수 있는 oligo dT primer를 넣어줌. 이후 reverse transcriptase를 이용해서 cDNA를 제작해줌. 다음으로 RNase H를 넣어 RNA를 부분적으로 digestion시켜줌. 이후 DNA polymerase I을 넣어줄 시 부분적으로 남아있는 RNA 절편들이 primer처럼 작용해서 중합이 진행되게 됨. 그리고 마지막으로 DNA ligase를 넣어 gap을 메꿔주면 완벽한 ds-cDNA가 만들어짐.

 

 

그렇다면 왜 cDNA를 만드는 것이 중요할까. 우리는 gene 그 자체보다는 gene의 발현 양상에 더 관심이 많음. 따라서 cDNA의 양상을 보게 되면 결과적으로 mRNA의 발현향상을 파악할 수 있음. (mRNA는 매우 불안정하므로, 이 녀석을 더 안정한 cDNA의 form으로 변환한 후 관찰하는 것) 물론 발현 양상을 보려면 protein을 보는 것이 가장 좋겠지만, 이는 아직 기술적으로 한계점이 많은 상황임.

 

 

 

 

다음으로 PCR에 대해 알아보자.

 

 

PCR은 매우 소량으로 존재하는 짧은 linear DNA에서 특정 sequence 부분을 in vitro 하에서 다량으로 copy해내는 과정임. (한편 다량의 DNA, 혹은 circular DNA를 증폭시키고자 하는 경우에는 일반적으로 cloning method를 많이 이용함)

 

PCR을 위해서는 primer를 design해야 하는데, 이를 위해서는 우리가 target하고자 하는 sequence 자체를 알아야 하므로, 예전에는 primer를 design하는 것도 잘 하지 못했음.

 

 

 

 

위 그림에는 PCR의 대략적인 과정이 나타나 있음. 보면 고온(92-95도, DNA 변성), 저온(45-65도, primer 결합), 중온(65-75도, DNA 중합)의 한 cycle을 계속적으로 반복해나가며 DNA의 특정 부분을 증폭시키게 됨. (이 때 이러한 cycle을 자동화시키기 위해서는 고온에서 버틸 수 있는 polymerase가 필요하고, 그렇기에 우리는 PCR을 위해 고세균이 가진 taq polymerase 등을 활용함)

 

 

이 떄 증폭되는 DNA의 양은 점점 saturation되는 형태로 변하게 되는데, saturation이 가까워오는 시점에 다다르면 넣어준 nucleotide가 동나서 더이상 duplication이 일어나지 않게 됨.

 

 

한편, RT-PCR(reverse transcription PCR)이라는 기법이 있는데, 이 기법은 cDNA를 이용해 수행하는 PCR을 의미함. 이 때 최종 DNA 양의 차이는 처음 존재하는 DNA 양의 차이와 같은 대소관계를 가질 것이므로(cycle의 횟수가 똑같으므로 차이는 계속 유지) 이를 이용해 상대적인 mRNA 발현량을 비교하게 됨. 그러나 이런 방법이 그다지 정확하지는 않으므로, 조금 더 정량적으로 cDNA의 양을 측정하기 위해 고안된 방법이 바로 qPCR(quantitative real-time PCR)임. 예를 들어 SYBR green dye를 쓸 시 PCR을 통해 duplication될 때마다 빛이 발생하게 됨. 이 때 이미 initial control된(이미 길이가 잘 알려져 있으며 길이가 거의 변하지 않는 housekeeping gene(e.g. rRNA gene) 등을 이용해 initial control curve를 그림) 녀석과 분석하고자 하는 녀석의 빛 intensity를 비교해서 상대적인 양을 측정하게 됨.

 

 

 

다음 포스트에서는 DNA sequencing에 대해 알아보자.