놀면서 공부하기

이번 포스트에서는 형광단백질을 단백질에 붙여 단백질의 위치를 파악하는 방법에 대해 알아보자.  in vivo상에서 protein의 location을 확인하기 위해 immunofluorescence 방법을 이용할 수도 있지만, 가장 대표적으로 많이 사용되는 것 중 하나는 GFP(green fluorescent protein)임.    실제로 GFP는 해파리에서 처음 발견되었으며 위 그림 (b)와 같이 생김. 이 녀석을 tagging한 protein의 경우 green을 띄기 때문에 실제로 imaging을 통해 이 녀석의 위치를 localization하는 것이 가능함. 특히나 위 그림 (d)와 같이 다양한 색을 낼 수 있는 GFP variant들이 존재하고 있으므로 이제 이 방법을 이용할 시 multi-lab..

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어 PCR에 대해 알아보자.  우선 qPCR에 대해 알아보자.    위 그림은 qPCR과 관련된 모식도를 보여주고 있음.   실제로 qPCR을 하게 되면 위 그림과 같은 결과를 얻을 수 있음. 이 때 signal이 특정한 threshold보다 더 높아지기까지 필요한 cycle의 수를 바탕으로 시작할 때의 nucleotide 양을 quantify할 수 있음. (실제로 cycle마다 대략 2배씩 증폭되므로 cycle을 계속하면 결국에는 threshold에 도달될 수 있음) 이를 위해 크게 두 가지 방법을 사용할 수 있음. 우선 1a의 경우 SYBR green과 같은 dye를 사용해서 DNA에 incorporate되는 정도를 측정하고, 결과적으로 DNA 양을 quantify할..

이번 포스트부터는 PCR에 대해 알아보자.  PCR는 linear DNA 중 일부 부위를 amplify하기 위해 사용할 수 있음. 혹은 더 나아가서 완전한 circular plasmid를 amplify하고자 할 때도 사용할 수 있음. 이 PCR은 cloning을 하기 위해 필요한 gene of interest를 증폭하는 과정으로도 많이 사용됨.  PCR을 위해서는 target DNA, primer(oligonucleotides complementary to target), nucleotide(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), thermostable DNA polymerase를 mix해주어야 함. 이 mix는 다음으로 thermocycler로 들어가게 되며, 우선 95도로 DNA를 melting..

지난 포스트에 이어서 클로닝에 대해 조금 더 알아보자.  이제 cloning vector에 대해 알아보자. 일단 대표적인 cloning vector에는 plasmid가 있음. plasmid는 circular한 DNA이며 일반적으로 negative supercoil을 가지는 intact한 form으로 존재함. 이 녀석은 원래 bacterial genomic DNA의 일부로 존재했는데, 이를 separate해서 사용하게 된 것임.  이들은 origin of replication을 가지기 때문에 host cell에 들어갈 시 자체적으로 replicate하는 것이 가능하며, 보통은 selection을 위해 antibiotic resistance gene을 가지고 있음. 이들의 경우 보통 15,000bp정도 si..

지난 포스트에 이어 이번 포스트에서 DNA cloning에 대해 더 알아보자.   DNA ligase에 대해 알아보자. DNA ligase가 작동하기 위해서는 조효소가 필요함. 이 녀석은 두 개의 DNA fragment 사이를 phosphodiester bond로 연결해서 중합체를 만들어주는 효소임. 이 녀석은 보통은 DNA repair에 쓰임. (참고로 human DNA ligase는 ATP를 조효소로 사용하고 bacterial DNA ligase는 NAD를 조효소로 사용함)    실제로는 위 그림과 같이 dsDNA를 연결할 때 ligase가 사용될 수 있으며 nicked DNA/RNA를 연결하는 과정에서도 ligase가 사용될 수 있음.  위 그림 오른쪽에 나타나 있는 T4 DNA ligase는 ty..

이번 포스트부터는 DNA 클로닝(cloning)에 대해 알아보자.  recombinant DNA는 자연 상태에서는 발견되지 않는, 인위적으로 만들어준 DNA를 의미함. 이걸 만들기 위해서 사용되는 과정이 바로 molecular cloning임. 한편 cloning된 유전자를 다른 개체에 넣어서 그 개체가 recombinant DNA를 가지고 있게끔 하도록 만들어주게 됨. 이를 통해 결과적으로 transgenic animal을 만들거나, GMO food를 만드는 등의 일을 할 수 있음.    DNA cloning 방식을 처음으로 고안한 분이 바로 위 그림에 표시되어 있는 Paul Berg이며, 그는 이에 대한 공로로 1980년에 노벨화학상을 받음.    Paul Berg는 위와 같은 연구를 함. 보면 vi..

이번 포스트에서는 지난 포스트에 이어 구체적인 NGS 방식들에 대해 하나하나 알아보자.  우선 pyrosequencing에 대해 자세히 알아보자.    위 그림은 pyrosequencing의 원리를 나타내주고 있음. pyrosequencing은 Roche에서 2004년에 개발되었으며, 이 때의 상품명을 따 454 pyrosequencing으로도 부름.  보면 특정 종류의 dNTP를 넣었을 때 DNA가 elongation된다면, 이 때 pyrophosphate가 방출됨. 이 때 이 녀석에 ATP sulfrylase와 adenosine이 가해지게 되면 ATP로 바뀌게 됨. 이후 ATP가 input으로 들어가면서 luciferin이 oxyluciferin으로 변화하게 되면서 light이 방출됨. (이 때 lu..

이번 포스트부터는 각종 NGS(next generation sequencing) 방법에 대해 알아보자.  NGS를 이용하면 high-throughput으로 whole genome을 sequencing할 수 있음. 이 방법의 경우 short read임에도 massively parallel sequencing을 수행할 수 있음.  typical한 NGS의 workflow는 library preparation→cluster generation→sequencing→data analysis의 순서임. 이 중 library preparation에서는 우선 DNA를 조각조각냄. 이후 5', 3'에 우리가 이미 알고 있는 tag를 붙여줌. 그 다음에 cluster generation을 통해서 이들 DNA 조각들을 증폭..

이번 포스트부터는 DNA 시퀀싱(DNA sequencing)에 대해 알아보자.  DNA sequencing은 다양한 방법으로 수행할 수 있음. 우선 가장 먼저 개발된 Maxam-Gilbert Sequencing method에 대해 알아보자.   보면 이 경우 G 앞을 끊어주는 reaction, A reaction, T reaction, C reaction 등 condition을 달리해가면서 특정한 염기만 끊어지는 환경을 조성해줌. 이후 gel을 내려주게 되면 위 그림 왼쪽과 같은 결과가 나오고, 이 때 아래에서부터 위 순서로 sequence를 읽어나가게 되면 sequencing을 할 수 있게 됨.  그러나 이 방법의 경우는 보다시피 꽤나 복잡함. 이 때 game changer가 나타남. 그것이 바로 아래..

이번 포스트에서는 DNA 합성(DNA synthesis)에 대해 알아보자.    DNA 합성을 위해서는 최소한 위와 같은 component들이 필요함. 일단 기본적으로 물, nucleotide, template DNA, primer, enzyme, buffer가 필요하며, 이 buffer는 pH를 조절해주는 역할을 함. 그 밖에 Mg2+와 같은 metal ion들도 들어가야 하는데, 그 이유는 이들이 polymerization 반응에서 상당히 중요하게 사용되기 때문. (사실 이 녀석은 restriction enzyme이 작용할 시에도 중요함)    위 그림에는 실제로 DNA가 합성되는 과정이 나타나 있음. 보면 3' OH가 incoming α phosphate를 SN2 attack하게 되고 그 결과 β,..