1. 이중교차(double crossover, DCO)
앞서 single crossover를 통해서는 두 개 gene의 cM값, 즉 상대적인 distance를 알 수 있었음. 한편 double crossover(DCO)의 경우 일단 확률적으로 일어날 가능성이 너무 낮음.
위 그림에는 DSO의 결과물이 나타나 있는데, 보면 recombinant와 paternal chromosome을 비교해 볼 시 딱 가운데 부분만 다름.
결국 DSO를 이용할 시 두 gene 사이에 위치한 세 번째 gene의 존재를 알 수 있고, 그 결과 gene들의 순서를 결정하는 것이 가능함.
한편 3개의 gene들 사이의 상대적 위치 관계를 결정해서 mapping을 수행하고자 할 때, 아래의 세 가지 criteria를 반드시 만족해야 함.
1. parent는 반드시 우리가 고려하고 있는 세 가지 gene에 대해 heterozygous해야 함.
2. phenotypic ratio가 genotypic ratio를 reflect하게 하기 위해서 교배 시 homozygote recessive를 사용해야 함. (다만 만약 우리가 관심을 가지고 있는 gene이 sex chromosome에 있는 gene일 경우 male의 경우 recessive gene이 1개만 있어도 괜찮음)
3. 제대로 된 결과를 얻기 위해서는 반드시 많은 수의 offspring이 얻어져야 함.
echinus(성게)의 eye shape 유전을 예로 들어 살펴보자.
보면 P_1 generation에서의 female은 y, w, ec가 한 chromosome에 linked되어있으며, male의 경우 y^+, w^+, ec^+가 한 chromosome에 linked되어 있음.
이렇게 해서 얻어진 F_1 generation 중 y, w, ec/y^+, w^+ ec^+을 가진 female과 y, w, ec/Y를 가진 male을 교배하였고, 그 결과 나타난 F_2 generation의 phenotypic ratio를 관찰해봄.
그 결과 crossover가 일어나지 않은 parental chromosome에 의해 발생한 phenotype이 압도적으로 많이 관찰되었고, 그 다음으로 y, w 사이에서 일어난 single crossover에 의해서 나타나는 phenotype이 많이 관찰되었으며, 다음으로 w, ec 사이에서 일어난 single crossover에 의해서 나타나는 phenotype이 많이 관찰되었고, 마지막으로 y, w^+, ec 혹은 y^+,w, ec^+ 에 의해 나타나는 phenotype이 가장 적게 관찰되었음.
일단 SCO data를 비교해보는 것을 통해 우리는 y, w간의 거리가 w, ec간의 거리보다 더 가깝다는 것을 알 수 있고, 이와 더불어 DCO data를 통해서 y, ec gene 사이에 w가 위치하고 있다는 것을 알 수 있음.
추가적으로, 전체 offspring이 10,000개라는 것을 알고 있다면 아래와 같이 각각에 대한 phenotypic frequency도 아래와 같이 계산할 수 있음.
정리하자면, gene sequence를 결정하기 위해서 아래와 같은 process를 따라 분석을 수행하면 됨.
1. 우선 offspring 중 parental type을 찾음. (일반적으로 가장 수가 많은 type이 바로 parental type임.
2. DCO type을 찾아 가운데 gene이 무엇인지 결정함. (일반적으로 가장 수가 적은 type이 바로 DCO type임.
3. SCO data를 분석해 각 gene 사이 recombination frequency를 결정함.
방금의 예시는 gene 3개가 sex chromosome에 있었음. 그렇다면 gene 3개가 상염색체에 있는 경우에는 어떻게 mapping할 수 있을까.
이를 위해서는 homozygote recessive를 사용한 test cross를 수행하면 됨. 이후 test cross 결과 나타나는 phenotype을 관찰하면 결과적으로 genotype을 확인할 수 있음. 따라서 앞서와 같은 방법을 이용하게 되면 mapping을 수행할 수 있음. (다시말해 성염색체 연관 gene들의 경우에는 그냥 정상 phenotype을 보이는 male만을 사용하면 되었지만, 성염색체 연관 gene들의 경우에는 정상 phenotype을 보이는 homozygote와 비정상 phenotype을 보이는 homozygote를 교배해야 함)
위 그림에는 상염색체 위에 존재하는 3개의 gene들을 mapping하는 것과 관련된 간단한 예시가 나타나 있으므로 참고할 것.
2. interference, coefficient of coincidence
두 gene간의 거리가 멀면 멀수록 이들 gene 사이에서 1회 이상의 교차가 일어날 확률이 증가함. 결과적으로 두 gene 사이에 짝수번의 교차가 발생하게 된다면 recombinant phenotype이 겉으로는 관찰되지 않음.
따라서 이런 현상에 의해서 두 gene 간의 거리가 멀면 멀수록 recombinant chromatid의 %는 기대치보다 작은 값으로 도출됨. (위 그림 왼쪽 아래 graph 참조)
이와 관련된 아주 흥미로운 두 가지 개념이 있는데, 바로 interference와 coefficient of coincidence임.
interference는 특정 지점에서 crossover가 일어나게 되면 그 지점으로부터 가까운 곳에서의 추가적인 crossover가 inhibition되는 현상을 의미함.
한편 coefficient of coincidence(병발계수, 병발률)는 기대되는 DCO 수에 대한 실제 DCO 수의 상대적인 비율을 의미함. 즉, coefficient of coincidence(C)는 아래와 같이 계산됨.
그렇다면 이 때 expected DCO는 이론적으로 어떤 식으로 구할 수 있을까. 이는 아래와 같이 구해질 수 있음.
한편 interference I와 coefficient of coincidence C 간에는 아래와 같은 관계가 있음.
I가 커졌다는 뜻은 interference 정도가 심해서 crossover가 2번 일어나기 힘들다는 것인데, 그렇다면 결과적으로 C 값은 감소하게 될 수 밖에 없음. 결과적으로 I와 C는 위와 같이 anti-correlation을 가지고 있음.
한편, gene 간의 거리가 증가하게 되면 I 값은 자연스레 감소하게 될 것이고, 그 결과 C는 증가하게 될 것임.
정리하자면, 간섭은 다중교차의 기회를 감소시킴.
+) 참고로 I는 대부분 양수이지만, 예상 DCO 수보다 실제로 더 많은 DCO가 발생하는 희귀한 경우에는 I가 음수로 나올수도 있음. (이 경우 C는 1보다 커질 것임)
3. 다양한 생물에서의 chromosome mapping
Drosophila(초파리), maize(옥수수), mice(쥐) 등에서의 수많은 mutant들을 이용해서, 이들 organism들 각각에 대한 extensive chromosome mapping을 수행해봄.
특별히 Drosophila는 위와 같은 침샘염색체를 가지고 있는데, 이 침샘염책체는 엄청나게 거대하기 때문에 거대염색체(giant chromosome)으로 분류됨. 이 녀석의 경우 염색분체의 분리 없이 복제만 끊임없이 이루어지기 때문에 같은 서열이 수없이 많이 복제된 상태로 한 세포 내에 남아있게 됨.
(참고로 이 때의 거대염색체는 풀려있는 상태일 경우에도 눈으로 관찰 가능할만큼 매우 거대한데, 이 때 눈으로 관찰되는 구조를 일컬어 퍼프(puff)라고 부름)
4. lod score analysis, cell hybridization
lod score method란 2세대의 가계를 조사하여, 부모의 2개 종류 표지가 특정한 아이에게 동시에 전달되었는지를 조사하는 방법을 의미함. 이 과정에서 만약 두 표지와 관련된 2개의 gene이 서로 연관되어 있지 않다면 두 gene들은 50%의 확률로 같은 자손에게 전달될 것이고, 두 gene이 서로 연관되어 있다면 50%보다 높은 확률로 같은 자손에게 전달될 것임.
다음으로 somatic cell hybridization(체세포 잡종기술)에 대해 알아보자.
우선 polyethylen glycol을 이용해서 사람의 cell과 쥐의 cancer cell을 융합함. 그러면 heterokaryon(이핵체)가 형성되는데, 이 때 heterokaryon이란 한 cell에 두 개의 핵이 모두 존재하는 상태의 cell을 의미함. 이후 시간이 더 지나고 나면 synkaryon 혹은 hybridoma cell이라 불리는 녀석이 형성되게 됨. 이들이 형성되는 과정에서는 heterokaryon 내부에 존재하던 두 개의 핵이 하나로 융합되게 되는데, 이 과정에서 사람의 염색체가 아주 random하게 소실되게 됨. 그 결과 형성된 hybridoma cell은 mice의 염색체와 사람의 염색체 일부씩을 가지고 있는 녀석임.
그 이후에는 밴딩기술(염색 등)을 이용해서 남아있는 염색체를 동정하게 됨. 이러한 동정 과정을 다양한 hybride cell에 대해 수행한 후 우리가 관심을 가지고 있는 특정 gene의 표현형을 특정한 뒤 관찰하게 됨.
예를 들어 우리가 관심을 가지고 있는 gene이 D라고 해보자. 이 때 gene D의 expression이 관찰된 23, 34, 41의 hybrid cell line을 관찰한 결과가 위 표에 나타나 있음. 그런데 이 과정에서 모든 hybrid cell이 공통적으로 가지고 있는 chromosome은 1번 하나뿐임. 결과적으로 chromosome 1에 gene D가 있다는 것을 추측할 수 있음.
다만 이러한 결론을 내기 위해서는 핵형 파악을 통해서 chromosome 1이 위 그림 오른쪽처럼 deletion되지 않고 위 그림 왼쪽과 같이 온전한 형태로 남아 있음을 확인해야 할 것임.
5. chromosome mapping by using DNA marker - RFLP, SNP, GWAS, CAPS
최근에는 chromosome mapping을 위해 DNA marker를 많이 사용함. 이 때 사용 가능한 DNA marker의 대표적인 예가 바로 RFLP와 microsatellite임.
RFLP는 restriction fragment length polymorphisms의 약자임. 앞서 살펴본 것처럼 RFLP는 dominant gene과 recessive gene 중 하나만을 특이적으로 자르는 restriction enzyme을 이용해 DNA를 잘랐을 때 나타나는 polymorphism을 의미함.
한편 microsatellite는 인간 chromosome 내의 short repetitive sequence로 (2~5bp 길이이며 5~50번 정도 반복됨) 이 녀석을 이용할 시 특정 서열의 위치를 파악하는 것이 가능함.
더 나아가서 이제는 심지어 single-nucleotide polymorphism(SNP)까지도 이용함. 일반적으로 SNP는 disease에 대한 screening을 수행할 때 많이 사용됨.
이보다 더 많은 정보를 얻고자 하는 경우라면, GWAS(genome wide association study)까지도 수행함. GWAS는 genome 중에서 내가 관심있는 형질과 association 되어있는 gene들을 찾는 연구 방법임.
대표적인 예로 GWAS를 이용해 cystic fibrosis associated gene을 탐색해 본 결과 7번 chromosome에 관련 gene이 존재하고 있다는 것을 알게 됨.
다음으로 CAPS(cleaved amplified polymorphic sequences) mapping이라는 기술에 대해 알아보자.
CAPS mapping을 위해서는 CAPS marker가 사용될 수 있는데, CAPS marker는 SNP의 존재여부를 판단하기 위해 사용하는 marker임.
위 그림에 CAPS mapping의 과정이 나타나 있음. 우선 처음에는 우리가 관심있는 특정 gene 부위를 PCR을 이용해 증폭함. 이후 wild type과 mutant 둘에서 차이가 나는 서열 부위를 딱 자르는 restriction enzyme을 처리한 뒤 전기영동을 통해 DNA fragment pattern을 관찰함.
이와 관련된 예시 하나를 살펴보자.
이 경우 col에 ore 14 mutation을 일으킨 개체(long living mutant)를 Ler(normal)과 교배함. (이 때 col이 열성) 그 결과 phenotypic ratio는 wild-type : delayed = 3 : 1이었음.
이 때 우리가 위치를 아는 특정 CAPS marker(Col에 위치)를 자르는 restriction enzyme을 이용하게 되면, 이 때 col의 ore 14 mutation 부위와 CAPS marker 간 거리에 따라서 mutation 부위가 제한효소에 의해 잘린 fragment에 위치할 수도 있고, 잘리지 않은 DNA상에 위치할 수도 있음. (즉, 이미 CAPS marker 부위, 즉 restriction site 부위를 알고 있으므로, 이 부위에 의해 잘린 조각 안에 mutation site가 있을 시 CAPS marker 사이 지점에 mutation이 일어났음을 알 수 있고, 만약 이 부위에 의해 잘린 조각 바깥, 즉 나머지 DNA 부위에 mutation site가 있을 시 CAPS marker보다 더 바깥쪽 부위에 mutation 부위가 있음을 알 수 있음.
이를 이용해(즉, marker와 mutation 부위 간의 상대적인 순서관계를 이용해) mutation 부위를 mapping하는 것이 가능함.
위 그림은 CAPS mapping의 또 다른 예시를 보여주고 있으므로 참고할 것.
6. 자매 염색분체(sister chromatid) 사이에 일어나는 exchange
놀랍게도 후속 연구 결과, mitosis 동안에 sister chromatid exchange(SCEs)도 일어난다는 것이 확인됨. 그러나 당연히 sister chromatid의 동일 locus 간의 exchange이므로 이를 통해 새로운 allelic combination이 만들어지지는 않음. (참고로 SCE의 과정은 crossover와 유사함)
7. 정방향 유전학(forward genetics), 역방향 유전학(reverse genetics)
한편 유전학의 연구방법을 크게 두 가지로 나누면 정방향 유전학과 역방향 유전학으로 나눌 수 있음.
forward genetics는 EMS와 같은 chemical, 혹은 TMT, 혹은 irradiation등을 이용해서 무작위로 돌연변이를 일으켜본 후 mutant의 phenotype 관찰을 통해서 phenotype-gene 간의 관계를 규명하는 접근법임. 한편 reverse genetics는 특정 gene을 특이적으로 mutation 시킨 후 phenotype을 관찰하는 접근법임.
여기까지가 chapter 3의 내용임. chapter 4에서는 성염색체(sex chromosome)와 성 결정(sex determination)에 대해 알아보자.