[생화학] 7.5 : DNA - 3

 

 

이번 포스트에서는 DNA의 변성(denaturation)에 대해 알아보자.

 

 

 

 

DNA는 위와 같은 과정을 거쳐 denaturation됨. 실제로 이를 촉진시켜주기 위해 온도를 높혀주거나 혹은 base, 즉 염기 성분을 처리해주어서 base pairing을 breaking해주는 등의 외부자극을 줄 수 있음. 물론 이 DNA denaturation은 reversible한데, 다시 말해 조건 조절에 의해 annealing을 유발할 수 있음.

 

참고로 PCR 등에서 annealing을 시킬 때는 Tm(melting temperature) 값보다 5도 정도 낮게 setting함.

 

 

 

 

위 graph는 x축을 온도, y축을 denaturation 정도로 해서 그린 graph임. 이 때 denaturation 정도는 nucleotide absorption을 가지고 판단하게 됨. 위 graph 위쪽에 나와있는 것처럼 ssDNA가 dsDNA보다 c 값이 더 적음. 그러므로 A가 고정되어 있다고 생각하면 결국 ssDNA에서 dsDNA에서보다 extinction coefficient 값이 더 크다는 것을 알 수 있음. 다시 말해 denaturation이 일어날수록 absorption 정도가 더 커지게 됨.

 

 

위 그림은 온도에 따라 흡광도를 잰 결과 얻어진 것임. 이 때 Tm 온도는 denaturation이 50% 정도만큼 되었을 때의 온도임.

 

 

 

 

참고로 PCR을 할 때 쓰는 짧은 nucleotide의 Tm 계산을 할 때는 GC의 number에 4를 곱하고 AT의 number에 2를 곱해 더하는 식으로 대략적으로 계산할 수 있음.

 

 

 

 

한편 위 graph에서도 알 수 있듯 DNA 중 GC contents가 높을수록 Tm 값이 높고 그 밖에 길이가 길어도 Tm 값이 보다 더 높음.

 

그리고 high salt 환경, 혹은 high Mg 환경에서는 DNA double helix의 phosphate backbone에 이들이 ionic interaction하며 DNA가 더 stabilize되어서 그 결과 Tm 값이 더 커지게 됨.

 

 

+) IDT라는 회사의 site에서 tool로 들어가서 oligoanalyzer를 연 뒤 sequence와 environment를 입력하면 대략적으로 Tm 값을 계산할 수 있음. 

 

 

 

 

한편 위 graph에서는 각종 rRNA의 melting temperature를 보여주고 있음. 보면 thermophilic bacteria가 가지는 rRNA의 경우 melting temperature가 높고 그 결과 이 녀석들은 높은 온도에서도 작용 가능함. 이 때 당연히 stable한 rRNA의 경우 GC contents 또한 많다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

 

한편 quantitative PCR이 위 그림에 나타나 있음. 이 때 Ct라는 값이 중요한데, Ct란 특정 양에 도달하기까지 몇 번의 cycle을 거쳐야 하는지를 의미함. 즉, 이 값이 적을수록 처음의 유전자 양이 많은 것임.

 

 

이를 구현하기 위해 위 그림 아래와 같이 TagMan probe를 달아놓거나(오른쪽), 혹은 그냥 DNA 염색 dye를 넣는(왼쪽) 방법을 사용할 수 있음. 특히 오른쪽 방식의 경우 polymerase가 polymerization을 하는 과정에서 이 probe가 분해되면서 형광이 나타나게 되고 이를 detection할 시 real-time으로 유전자의 양을 확인할 수 있음.

 

 

 

 

앞서의 과정을 거쳐 cycle을 다 돈 다음 온도를 쭉 올림. 그러면서 fluorescence를 측정함. (결국 Tm의 값을 측정) 이 과정에서 peak이 위 그림 오른쪽과 같이 하나만 나오는 경우 진짜 우리가 원하는 specific한 product가 나왔음을 확인할 수 있음. 그 밖에 위 그림 왼쪽과 같이 peak이 여러 개 나오는 경우 non-specific한 product가 생겼다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

한편 세포 내에서 특정 부분이 replication 되기 위해서는 AT rich한 것이 더 유리할 것임.

 

 

 

 

다음 포스트에서는 RNA에 대해 알아보도록 하자.