[분자생물학] 10.1 : 진핵생물의 RNA polymerase - 1

 

 

이번 포스트부터는 진핵생물(eukaryote)의 RNA polymerase에 대해 알아보도록 하자.

 

 

 

eukaryote와 prokaryote에서의 전사 방식은 비슷한듯 하면서도 다름. 일단 전사에 있어 핵심적인 역할을 하는 RNA polymerase부터 다른데, 앞서 살펴보았던 prokaryote의 경우 한 종류의 RNA polymerase만을 가지지만 지금부터 살펴볼 eukaryote의 경우 3종류의 RNA polymerase를 가짐.

 

 

 

 

진핵생물이 가진 RNA polymerase의 정체에 대해 잘 몰랐던 과거에도, 진핵생물은 최소한 두 종류 이상의 RNA polymerase를 가질 것이라 추측했음. 그 이유는 세포의 핵(nuclei) 내부에 인(핵소체, nucleolus)이라는 구조가 별도의 compartment 안에 존재하고 있었기 때문임.

 

인이라는 부분에서 rRNA가 합성되고, 이곳에서 ribosome이 조립된다는 사실은 익히 알려져 있었는데, 이 때 rRNA를 encoding하는 gene들의 경우 다른 nuclear gene과는 base composition이 확연히 달랐음. (한 예로, rat에서의 측정 결과 일반적인 gene들의 경우 GC contents의 비율이 40%인 반면 rRNA를 encoding하는 gene들의 경우 GC contents의 비율이 60%에 육박했음)

 

 

그리고 rRNA gene들은 비정상적으로 repetitive하다는 것을 발견함. (수백~수만에 이르기까지 특정 서열들이 반복적으로 나타남) 따라서 핵의 다른 부위에서 작용하는 RNA polymerase와 더불어 nucleolus라는 구조에서는 다른 종류의 RNA polymerase가 작용할 것이라고 생각함.

 

 

 

조금 더 확실하게 RNA polymerase의 종류가 구분된 것은 eukaryotic nuclei가 포함하고 있는 단백질들을 대상으로 ion-exchange chromatography를 수행하여 아래와 같은 결과를 얻은 이후임.

 

 

 

 

우선 실험 과정을 하나하나 살펴보자. sea urchin의 embryo로부터 얻은 extract를 DEAE-Sephadex chromatography를 이용해 분리함. 이 때 DEAE는 +charge를 띄는 녀석이므로 단백질 중 - charge를 띄는 부분과 결합할 수 있고, 이후 시간에 따라 염을 점차 높은 농도로 처리해주게 되면 정전기적 상호작용이 약해지며 charge 정도에 따라 다른 fraction으로 단백질이 분리되게 됨. 이렇게 해서 얻은 것이 위 결과임.

 

 

 

그런데 이 때 녹색으로 나타난 선은 무엇일까. 이는 A280을 의미하는데, 280nm에서의 흡광도임. 대부분의 단백질은 280nm의 빛을 흡광하므로 fraction 별로 단백질이 얼마나 함유되어 있는지를 파악할 수 있음. 이 때 앞쪽에 매우 높은 peak이 관찰된다는 것을 확인함.

 

 

그런데 우리가 관심 있는 부분은 40~60 fraction 쯤에 나타난 아주 낮은 초록 봉우리 3개임. 이들에 대한 추가적인 분석을 수행하기 위해 이 fraction들만 다시 얻은 다음, 여기에 UMP를 넣어서 RNA가 생합성 가능한 환경을 만들어 보았음. 그 결과 위 그림상에 붉은색으로 나타난 것처럼 크게 3개의 봉우리에서 UMP 생합성을 일으키는 단백질이 관찰됨을 확인함. 따라서 이 때 앞쪽 녀석부터 뒤쪽 녀석까지를 순서대로 RNA polymerase I, II, III라 명명함.

 

 

이후 각각의 RNA polymerase들이 어디에서 많이 발견되는지에 대한 정보를 얻기 위해 nucleolar(인) fraction과 neucleoplasmic(인을 제외한 핵의 나머지 부분) fraction을 대상으로 앞서와 동일한 실험을 수행함. (UMP incorporated activity를 측정함) 그 결과가 아래와 같음.

 

 

 

 

보면 nucleolar fraction의 경우 거의 RNA polymerase I만이 발견되는 반면 nucleoplasmic fraction에서는 RNA polymerase I, II, III가 다 발견되고, 그 중에서도 RNA polymerase II가 가장 높은 활성을 띄고 있음을 알 수 있음.

 

 

이 때 RNA polymerase I이 nucleolus에서 엄청 많이 발견되므로, 이 위치 분포를 토대로 RNA polymerase I이 rRNA gene을 전사하는 역할을 하지 않을까 하고 예상해볼 수 있음.

 

 

 

 

이후 분자생물학자들은 각종 실험을 통해 RNA polymerase에 의해 합성되는 생성물들이 RNA polymerase 종류에 따라 아래와 같이 다양함을 밝혀냄.

 

 

 

 

우선 RNA polymerase I의 경우 1차적으로 45S에 해당하는 large rRNA precursor를 전사해내게 되고, 이후 mature 과정에서 이 precursor로부터 다양한 크기의 rRNA들이 만들어지게 됨. 다음으로 RNA polymerase II의 경우 hnRNA(heterogeneous nuclear RNA, 이 녀석이 processing 후 mRNA로 변함), snRNA(small nuclear RNA, 차후 살펴볼 splicing에 관여), miRNA precursor 등을 전사하는 역할을 함. 마지막으로 RNA polymerase III는 5S rRNA procursor, tRNA precursor 등을 전사하는 역할을 함.

 

 

 

도대체 어떻게 이런 정보들을 얻었는지에 대해 의문을 품을 수 있음. 따라서 위 표에 나타난 것들 중 RNA polymerase III가 5S rRNA precursor, tRNA precursor를 만든다는 사실을 증명한 실험 결과를 예시로 살펴보고 넘어가자.

 

 

 

 

위 그림의 오른쪽에 나타난 alpha-amanitin은 Amanita phalloides라는 버섯이 분비하는 독성물질임. 이 물질은 신기하게도 RNA polymerase의 종류에 따라 각기 다른 독성을 발휘함.

 

 

 

 

위 그림의 x축은 alpha-amanitin의 농도, y축은 효소의 maximal activity임. 보면 RNA polymerase I의 경우 alpha-amanitin이 아무리 많아져도 전혀 활성에 영향을 받지 않는 것을 알 수 있음. 한편 RNA polymerase II의 경우 alpha-amanitin이 많아짐에 따라 급격히 활성이 감소하고, RNA polymerase III의 경우 II보다는 덜하지만 alpha-amanitin의 농도 증가에 따라 결국에는 활성이 감소하는 것을 알 수 있음.

 

 

이 때, alpha-amanitin의 농도가 10^{-1} ~ 10^{3} ug/mL인 구간에서는 II의 활성은 거의 0이고 III의 활성은 점차 떨어지며, I의 활성은 계속 유지되는 변화 양상을 보임. 이 구간을 이용하면 아래와 같은 실험 결과를 도출할 수 있음.

 

 

 

 

 

 

보면 앞서 말한 구간에 걸쳐서 alpha-amanitin의 농도를 서서히 높이면서 5S rRNA, 4S tRNA precursor의 합성 정도를 비교해보았음. 결과적으로 위 그림에서도 나타나 있듯 alpha-amanitin의 농도를 구간 안에서 높임에 따라 5S, 4S RNA의 합성 정도가 감소함을 확인할 수 있음. 이 때 이 구간 하에서 지속적으로 활성이 감소하는 RNA polymerase는 III밖에 없음. 따라서 5S rRNA, 4S tRNA precursor의 전사에 관여하는 것은 RNA polymerase III임을 알 수 있음.

 

 

(참고로 위 그림에 나타난 결과는 labeled RNA를 isolated nuclei에 넣고 alpha-amanitin도 첨가해 준 상태에서 RNA 합성을 진행시켜주고, 이후 이를 추출해 PAGE gel을 통해 분리시켜준 다음 radioactivity를 관찰한 것임)

 

 

 

 

다음 포스트에서는 RNA polymerase II의 구조에 대해 알아보자.