[분자생물학] 10.1 : 진핵생물의 RNA polymerase - 2

 

 

 

이번 포스트에서는 RNA polymerase II의 구조에 대해 본격적으로 알아보도록 하자.

 

 

RNA polymerase 중에서도 mRNA 합성에 관여하는 RNA polymerase II에 대한 연구가 특별히 더 많이 진행되었으므로, RNA polymerase II의 구조에 대해 집중적으로 알아보는 것임.

 

 

우리가 앞서 RNA polymerase를 한 덩어리처럼 취급해서 마치 이 녀석이 하나의 polypeptide인 것처럼 여길 수도 있지만, 사실 이들은 많은 subunit들이 모여 만들어진 complex임. 그런데 연구 초반에는 어떤 것이 subunit이고 어떤 것이 conteminent(complex를 이루고 있지는 않지만 중간중간에 와서 잠시 붙었다 떨어졌다 하는 녀석. data 처리 과정에서는 일종의 오염물)인지를 구분하는 것이 쉽지 않았음. 이를 개선하고자 아래 그림에 나타난 것과 같은 epitope tagging 기술을 사용해 subunit들을 identify함.

 

 

 

 

보면 위 그림상에 파란색으로 나타난, 이미 subunit임이 확실시된 단백질(이 실험상에서는 Rpb3)에 epitope tag를 붙인 상태에서 anti-epitope antibody를 사용해 co-immunoprecipitation을 시킨 다음 SDS를 처리해 각 subunit들을 다 분리시켜주고 이들을 electrophoresis로 분리시켜 관찰하는 방식을 사용하게 됨. (즉, 이 방법을 이용해 정체를 아는 Rpb3 단백질과 같이 붙는 녀석들이 무엇인지를 확인함)

 

 

 

 

 

이 실험으로부터 얻은 결과가 위 그림에 나타나 있음. 이 때 결과를 관찰하기 위해서는 labeling을 수행해야 했는데, 단백질을 합성하는 과정에서 사이사이에 [35S] methionine이 끼어들어가게 해서 단백질을 labeling하였고, 그 밖에 phosphorylation되는 단백질들을 labeling하기 위해 [gamma-32P] ATP도 사용함.

 

 

우선 [35S] methionine로 labeling한 후 수행한 SDS-PAGE의 결과를 살펴보자. 위 그림의 맨 왼쪽 2개의 lane에 그 결과가 나타나 있음. 보면 크기에 따라 대략 10개 정도의 서로 다른 band가 나타남. 이 때 이들을 무거운 쪽에서 가벼운 쪽의 순서대로 Rpb1~10으로 명명함. (Rpb의 의미는 RNA polymerase b임. 과거에는 polymerase를 1, 2, 3으로 분류하는 학자들과 a, b, c로 분류하는 학자들이 다 존재했는데, 그 중 이 단백질명을 붙인 사람은 polymerase를 a, b, c로 분류하던 사람이었음) 한편 다음으로 [gamma-32P] ATP를 이용해 labeling한 후 수행한 SDS-PAGE의 결과를 살펴보자. 보면, Rpb1과 Rpb6에만 band가 나타남. 이는 Rpb1, Rpb6에서만 phosphorylation이 일어났음을 암시함.

 

 

 

한편 위 그림의 (b)에 나타난 결과는 (a)에서보다 더 높은 해상도(high-resolution)로 얻은 SDS-PAGE의 결과임. 보면 낮은 해상도에서는 같은 band로 여겨졌던 Rpb9, Rpb10 band가 알고보니 각각 두개씩의 band로 나뉘어지는 것이었다는 걸 알게 됨. 따라서 기존의 Rpb9 위치에 하나 더 나타난 band에 해당하는 단백질을 Rpb11로, 기존의 Rpb10 위치에 하나 더 나타난 band에 해당하는 단백질을 Rpb12로 명명함.

 

 

 

 

 

위 표는 총 12개의 Rpb 단백질들에 대한 물성치를 정리한 결과를 나타내고 있음. 이 때 stoichiometry는 단백질들끼리 interaction할 때 1:1로 하는지, 1:多로 하는지의 정도를 나타내는 수치임.

 

 

한편 epitope tagging을 수행하더라도 사실 contaminant가 딸려올 가능성이 항상 존재함. 따라서 정말 각 subunit들이 중요한 역할을 하는지를 알아보기 위해 각 subunit들을 encoding하는 gene들을 하나씩 deletion시켜보며 RNA polymerase II의 기능이 어떻게 변하는지를 관찰함. 그 결과가 위 표 맨 오른쪽에 나타나 있음.

 

 

 

이후 추가적인 연구를 통해 각 subunit들의 역할에 대해서도 어느 정도 이해하게 됨. 우선 Rpb1, Rpb2, Rpb3는 RNA polymerase II의 enzyme activity에 있어 매우 중요한(필수적인) 구성성분임. 이 때 이들은 각각 E.coli에서의 beta', beta, alpha subunit과 homologous하다는 것도 알게 됨.

 

 

 

 

조금 더 구체적으로 살펴보면, Rpb1과 \beta'-subunit 모두 DNA와의 binding에 관여함. 그리고 Rpb2와 beta-subunit은 모두 nucleotide-joining active site 주변에 존재함. 마지막으로 Rpb3와 alpha-subunit은 (물론 다소 다른 점도 많지만) 20개의 amino acid 정도가 매우 유사하며, 두 subunit이 거의 같은 크기, 같은 stoichiometry를 가지며, 둘 다 holoenzyme 당 2개의 monomer가 존재하는 등 공통점이 꽤 있음.

 

 

따라서 진핵생물에서 Rpb1, Rpb2, Rpb3들을 통틀어 core subunit이라 부름.

 

 

 

반면 Rpb5, Rpb6, Rpb8, Rpb10, Rpb12는 진핵생물의 RNA polymerase I, II, III에서 다 발견됨. 따라서 이들이 꽤나 fundamental하고 중요한 역할을 할 것으로 추정되나, 아직 이들의 function에 대한 이해는 부족한 상황임.

 

 

 

지금까지 설명하지 않은 Rpb 중에서 두 개는 activity에 있어 꼭 필요한 녀석들은 아니고, 나머지 두 개는 지금까지 설명한 category 중 어느 곳에도 포함시키기 어려움.

 

 

 

 

위 표에는 12개의 subunit에 대한 특성들이 정리되어 있으므로 참고할 것.

 

 

 

다음 포스트에서 RNA pol II에 대해 이어서 살펴보도록 하자.