[AAV] 6편 : AAV 실험 꿀팁 모음

 

 

 

AAV 실험, 처음엔 막막하죠. 플라스미드는 민감하고, 정제도 어렵고, 타이트레이션도 귀찮은데 정확해야 하니까요.

 

 

저도 처음엔 그랬어요. 다행히 실험실 선배들과 여러 시행착오 덕분에 조금씩 익숙해졌고, 지금은 프로토콜 여백에 적힌 작은 팁 하나하나가 실험 효율을 좌우한다는 걸 실감하고 있어요. 이번 글에서는 제가 직접 겪고, 실험실에서 공유된 실전 팁들을 소개할게요.

 

플라스미드 단계 – ITR은 까다롭지만 대응법이 있어요

 

 

AAV의 transfer plasmid에는 ITR(inverted terminal repeat)이 들어 있어요. 이 ITR이 있어야 바이러스에 유전자가 실리는데, 문제는 이 구조가 굉장히 불안정해서 쉽게 삭제된다는 거예요. 특히 일반적인 37도에서 키우면 이런 문제가 더 잘 생겨요.

 

✔ 팁 1. 30도에서 키워보세요. ITR 안정성은 온도에 민감해서, 저온 배양이 도움이 돼요.

✔ 팁 2. NEB Stable 같은 recombination-deficient 균주 사용도 효과적이에요.

✔ 팁 3. SmaI/XmaI로 ITR 존재 확인은 필수예요! 미니프렙으로 먼저 확인 후, 미디프랩, 혹은 맥시프렙으로 넘어가면 시간도 아끼고 돈도 절약돼요.

 

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트랜스펙션 단계 – PEI는 엑셀로 계산하고 여유분을 준비해요

 

 

AAV 생산은 보통 트리플 플라스미드 트랜스펙션으로 진행돼요. RepCap, pHelper, transfer 플라스미드를 비율 맞춰 넣어야 하죠.

✔ 팁 4. 엑셀 시트로 PEI 양을 계산하세요. 플라스미드 양, 세포 수, PEI 농도까지 미리 정리해두면 실험 준비가 훨씬 쉬워요.

✔ 팁 5. 바이러스는 항상 여유 있게 만들기! 실험 도중 부족하면 새로 만들기 어렵기 때문에, 항상 넉넉하게 준비하는 걸 추천드려요.

 

정제 단계 – PEG 귀찮을 땐 생략도 가능해요

 

 

PEG 침전은 생산량을 늘려주긴 하지만, 용액 준비가 정말 귀찮아요. PEG는 뜨거운 자석 교반기에서 몇 시간 동안 녹여야 하고, 점성이 높아서 필터링도 어려워요.

 

✔ 팁 6. 시간 없으면 셀 펠렛만 수확해도 돼요. 실험 목적이 in vitro라면, PEG 없이 세포만 모아서 lysis 후 정제해도 충분한 경우가 많아요.

✔ 팁 7. 셀 파쇄는 얼음-에탄올 bath로 4번 냉동/해동하면 깔끔하게 끝나요. 소닉레이터 없을 때 유용해요.

 

타이트레이션 – 정확도가 중요해요!

 

 

✔ 팁 8. DNase 처리 꼭 하세요. 플라스미드 DNA가 타이트이션에 섞이면 실제보다 높게 나올 수 있어요.

✔ 팁 9. 바이러스 희석 단계에서 희석 배수를 정확히 기록하세요. 계산 실수로 역가가 엉망이 되는 걸 방지할 수 있어요.

✔ 팁 10. MOI는 매 batch마다 새로 최적화해요. 같은 프로토콜이라도 바이러스마다 결과가 달라요. 적정 용량을 찾기 위해 2~3가지 농도를 비교해보는 게 좋아요.

AAV 실험은 복잡하지만, 이런 작은 팁들이 쌓이면 정말 실험이 쉬워져요. 처음엔 긴장되고 손이 떨리지만, 어느 순간부터 ‘어? 이 정도는 이제 괜찮네!’라는 생각이 들게 되죠. 그때까지 하나하나 천천히 익혀가면 돼요.

 

다음 편에서는 AAV 벡터에서 가장 중요한 요소 중 하나인 ITR의 구조와 안정성에 대해 자세히 소개해드릴게요.