[AAV] 8편 : AAV ITR 실전 문제 해결 가이드 – 삭제, 돌연변이, 안정성 유지법

 

 

 

AAV 실험이 생각보다 잘 안 될 때, 종종 원인을 추적하다 보면 ITR 문제에 닿게 돼요. AAV에서 ITR은 유전자의 복제, 포장, 발현 유지를 모두 관장하는 핵심 구조이기 때문에, 작은 손상도 실험 전체를 망칠 수 있어요.

이번 글에서는 ITR 관련 문제를 진단하고 해결하는 방법을 상황별로 정리해드릴게요.

 

상황 1: 바이러스 수율이 극단적으로 낮아요

 

 

가장 흔한 원인

✔ ITR 손상 또는 삭제
✔ 플라스미드 배양 중 돌연변이
✔ ITR 내 기능성 서열(RBE, trs) 돌연변이

 

해결 방법

SmaI 또는 XmaI 제한효소 처리로 ITR 확인: 정상 ITR이 있으면 명확한 밴드 패턴이 보여요.

Stbl3나 NEB Stable 균주에서 재배양해보세요. RecA 활성이 낮은 균주는 ITR 안정성이 좋아요.

30도에서 저속 배양하면 돌연변이 확률이 낮아져요. 특히 overnight culture 대신 24시간 이상 천천히 키워주는 게 좋아요.

그래도 안 되면 플라스미드 재클로닝을 고려해보세요.

 

상황 2: 타이터는 높게 나오는데 감염이 안 돼요

가능한 원인

✔ 빈 캡시드 비율이 높은 경우
✔ ITR은 있지만 기능을 상실했을 가능성
✔ qPCR 타겟이 ITR 내부 돌연변이 부위일 수도 있어요

 

해결 방법

타이트레이션을 qPCR + 감염 기반 방법으로 병행하세요 (예: TCID50).

다른 유전자 부위(gene of interest)로 qPCR 타겟을 바꿔서 재검토해보는 것도 좋아요.

가능하면 ddPCR을 활용해 정밀 타이테이션을 시도해보세요. 이 방법은 false positive 가능성이 낮아요.

 

상황 3: 플라스미드 시퀀싱이 계속 실패해요

가능한 원인
✔ ITR의 고GC·스템루프 구조 때문에 Sanger 시퀀싱 오류
✔ ITR 시퀀스가 중첩돼 조립 실패

 

해결 방법

시퀀싱 대신 제한효소 분석(SmaI/XmaI) 사용

NGS(차세대 염기서열 분석)로 부분 분석 시도 (특정 구간만 PCR 증폭해서 NGS)

일부 업체에서 ITR 시퀀싱 전용 조건을 제공하기도 해요. 이런 서비스를 활용하는 것도 방법이에요.

 

 

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 팁: 실험 시작 전에 미리 점검해두면 좋은 것들

플라스미드 재배양 시 동일한 colony를 여러 개 키워 비교 분석해보세요.

미니프렙 단계에서 ITR intact 여부를 확인한 후, 맥시프렙 진행하세요. 시간과 자원 절약에 좋아요.

ITR이 중요한 만큼, 플라스미드 보관 시도 짧은 기간 안에 새로 제작하는 걸 권장드려요.

 

보너스 – ITR을 아예 없애지 않고 '개선'하는 전략

요즘은 연구자들이 ITR을 단순히 지키는 것뿐만 아니라, 기능적으로 개선하려는 시도도 많아지고 있어요.

예를 들어,

D' 도메인을 제거하고 전사인자 결합 서열을 넣어 발현 향상

다른 serotype의 ITR을 사용해 새로운 발현 패턴 유도

ITR 자체를 enhancer처럼 사용하는 전략도 연구되고 있어요.

 

AAV 실험에서 ITR 문제는 초보자만 겪는 게 아니에요. 경험 많은 연구자들도 꾸준히 점검하고 관리해야 하는 핵심 포인트예요. 이번 편이 여러분의 실험에서 오류를 줄이고, 더 안정적인 결과를 얻는 데 도움이 되었으면 해요.