[분자생물학] 15.5 : mRNA processing과 전사의 연관성 - 1

 

 

 

이번 포스트에서는 mRNA processing 과정이 RNA 전사와 어떤식으로 관련되어 있는지에 대해 알아보자.

 

 

 

chapter 14에서 살펴본 splicing, polyadenylation, 5' capping은 모두 CTD와 관련되어 있었음.

 

 

 

 

 

 

따라서 위 그림과 같이 RNA polymerase II의 CTD가 일종의 processing platform으로 작용해서 processing을 매개하지 않을까 생각하게 됨.

 

 

 

splicing, 5' capping은 명백히 co-transcriptional process임. splicing의 경우 앞서 봤던 것처럼 CTD의 도움을 받아 assemble된 여러 splicing factor들에 의해 일어남. 한편 capping의 경우에도 마찬가지이고, 특히 capping의 경우 생합성된 mRNA의 길이가 30nt보다 짧을 때부터 일어나기 시작한다고 함. (polymerase로부터 mRNA의 5' end가 밖으로 삐죽이 튀어나오면 그때부터 capping이 시작됨)

 

 

다만 polyadenylation은 cleavage까지의 과정만 co-transcriptional하게 일어나고, 이후의 나머지 polyadenylation 과정은 명백히 post-transcriptional하게 일어남. 이에 대해 뒤에서 다시 살펴볼 것임.

 

 

 

결국 CTD가 platform 역할을 한다는 것을 입증하기 위해서는 CTD가 각종 processing에 관여하는 단백질들과 interaction한다는 것을 입증해야 함.

 

 

 

 

우선 위 실험 결과는 CTD, 그 중에서도 phosphorylated CTD가 (capping에 중요한) guanylyl transferase와 interaction함을 보인 것임. 이 때 수행한 실험은 affinity column chromatography이며, CTD를 resin으로 사용해서 같이 분리된 단백질들을 대상으로 guanylyl transferase assay를 수행함.

 

그 결과 위 그림 왼쪽과 같이 phosphorylated CTD에 결합되어 분리된 녀석들이 guanylyl transferase activity를 가진다는 것을 확인함. 결론적으로 phosphorylated CTD에 guanylyl transferase가 결합한다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

 

한편 위 그림에 나타난 실험은 splicing에 관여하는 U1snRNP의 일종인 (yeast에서 발견되는) Prp40과 CTD가 interaction을 하는지를 살펴본 것임.

 

 

이 때 사용한 실험 기법이 far western blot인데, 일반적인 western blot이 antibody를 사용하는 것과는 달리 far western blot에서는 antibody 대신, interaction 할 것으로 예상되는 다른 단백질(이 경우 CTD)을 사용함.

 

 

위 그림의 (a)는 우선 CTD와 binding 할 것으로 예상되는 후보 단백질들을 gel 상에 그냥 내려본 것임. 한편 (b)는 실제로 far western blot을 사용해서 CTD와 붙는 단백질만을 표지함. 그 결과 몇몇 signal들이 관찰되었는데, 그 중 Prp40도 있음. 즉, CTD에 U1snRNP도 recruit된다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

 

 

위 그림에 나타난 것은 capping enzyme, polyadenylation factor, RNAP II의 subunit 중 하나인 Rpb3에 대한 antibody를 사용해 ChIP assay를 수행한 결과임.

 

한편 위 그림의 위쪽에 나타나 있는 것처럼 ChIP assay를 통해 단백질과 함께 검출된 DNA에 대해 3종류의 gene(각 gene의 promoter 부위와 encoding 부위)을 일종의 primer로 사용해서 PCR을 진행시켜봤음. 그 결과가 위 그림에 나타나 있음.

 

 

 

우선 capping protein을 바탕으로 수행한 실험결과부터 보자. 이 경우에는 3가지 종류의 gene 중 promoter를 primer로 써서 PCR을 수행했을 때 signal이 나타남.

 

이는 결국 capping protein이 직접적으로든 간접적으로든 일단 promoter 부분의 DNA와 상호작용했다는 것을 뜻하고, 이를 다시 생각해보면 결국 capping protein이 promoter 부근에서만 전사 복합체 안에 포함되어 작동한다는 것을 알 수 있음. (즉, 전사가 진행되기 전에 capping protein이 complex를 이루고 있음. 실제로 elongation이 진행되면 capping protein은 complex를 따라가지 않아 complex 근처에 존재하지 않는 듯 보임)

 

 

다음으로 polyadenylation factor를 이용해 수행한 실험 결과를 보자. 이 경우 전반적으로 다 PCR 결과가 관찰됨. 이를 통해 polyadenylation factor는 전사가 시작될 때부터 진행되어 가는 과정 내내 transcription complex 내에 계속 포함되어 있다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

 

위 그림은 CTD의 5번 serine, 2번 serine에 인산기가 달렸을 때 이들을 각각 인지할 수 있는 antibody를 사용해서 ChIP assay를 수행하고, 이후 앞서와 마찬가지로 gene의 일부를 primer로 사용해서 PCR을 수행한 결과임. 보면 주로 promoter 근방에서는 5번 serine에 인산화가 되어 있으며, elongation 진행에 따라 5번 serine의 인산화 신호가 약해짐.

 

한편 elongation이 진행됨에 따라 ((b) 첫번째 결과를 보면) 2번 serine의 인산화가 더 강하게 일어남. 이를 통해 CTD의 인산화 pattern이 promoter 부근에서는 5번에 인산화가 되어있던 것에서 elongation 진행에 따라 2번에 인산화가 되는 것으로 바뀌게 된다는 것을 알 수 있음.

 

CTD 인산기의 이러한 변화가 아마도 앞서 살펴본 processing protein들의 결합 pattern과 관련되어 있을 것으로 생각됨. (다시 말해 capping protein이 promoter 부근에만, 나머지 녀석들은 elongation을 하면서 계속 붙어 있는 경향성이 아마도 initiation, elongation에 따라 바뀌는 CTD 인산화 pattern에 따라 부여되는 성질일 것임)

 

 

 

 

 

이 결과들을 다시금 보기 쉽게 정리한 것이 앞서 등장했었던 위 그림임. 참고할 것.

 

 

 

그런데 CTD는 사실 많은 수의 heptad repeat을 가지며, 각 repeat마다 2, 5, 7번 serine이 있어 이곳에 phosphorylation이 될 수 있음. 따라서 이들 phosphorylation 조합에 따라서 processing regulation 과정이 바뀔 수 있지 않을까 하고 생각하게 되었고, 그래서 등장한 개념이 CTD code임.

 

 

 

 

다음 포스트에서는 poly A tail과 전사 종결의 연관성에 대해 알아보자.