멀티시스트로닉 벡터(Multicistronic Vector)란? IRES와 2A Peptide의 차이까지 한 번에 정리

 

 

분자생물학 실험을 하다 보면 두 개 이상의 유전자를 동시에 발현시켜야 하는 상황이 자주 생겨요.

예를 들어 Cas9과 GFP를 함께 발현하고 싶을 수도 있고, 특정 단백질과 selection marker를 동시에 발현하고 싶을 수도 있어요. CAR-T 연구에서는 receptor와 reporter를 같이 넣기도 하고, 바이러스 벡터를 만들 때도 여러 유전자를 하나의 construct 안에 담아야 하는 경우가 많죠.

이럴 때 가장 먼저 떠오르는 방법은 각각의 유전자에 별도의 promoter를 붙이는 것이에요. 하지만 promoter를 여러 개 사용하는 방식은 벡터 크기가 커지고, 유전자 간 발현량 차이가 발생할 수 있으며, 바이러스 패키징 용량에도 부담을 줄 수 있어요.

이 문제를 해결하기 위해 개발된 것이 바로 Multicistronic Vector예요.

 

Multicistronic Vector란?

 

 

Multicistronic vector는 하나의 mRNA에서 여러 개의 단백질을 동시에 생산하도록 설계된 벡터를 의미해요.

일반적인 진핵세포에서는 하나의 mRNA가 하나의 단백질만 번역하는 monocistronic 구조를 가져요.

DNA

↓

mRNA

↓

Protein

이 구조가 기본 원칙이에요.

하지만 multicistronic vector는 하나의 transcript 안에 여러 ORF(Open Reading Frame)를 배치해서 여러 단백질을 동시에 만들 수 있도록 설계돼요.

예를 들면

Promoter → Gene A → IRES → Gene B

또는

Promoter → Gene A → T2A → Gene B

와 같은 구조를 사용해요.

 

왜 Multicistronic Vector를 사용할까?

가장 흔한 목적은 reporter와 관심 유전자를 함께 발현시키기 위해서예요.

예를 들어 새로운 유전자의 기능을 연구한다고 해볼게요.

직접 해당 단백질을 검출하기 어려울 수도 있어요.

이럴 때 GFP를 함께 발현시키면 GFP가 보이는 세포만 선택하면 돼요.

즉,

GOI + GFP

를 함께 발현시키는 거죠.

특히 같은 mRNA에서 발현되기 때문에 GFP가 발현되는 세포라면 관심 유전자도 함께 발현되고 있을 가능성이 매우 높아요.

이 때문에 lentivirus, retrovirus, AAV 시스템에서도 매우 자주 사용돼요.

 

가장 대표적인 방법 ① IRES

 

 

IRES는 Internal Ribosome Entry Site의 약자예요.

원래는 폴리오바이러스 같은 RNA 바이러스에서 발견된 구조인데, 연구자들이 이를 벡터 설계에 활용하게 되었어요.

일반적으로 진핵세포에서 리보솜은 mRNA의 5' cap에서 번역을 시작해요.

그래서 하나의 mRNA에서는 하나의 단백질만 만들어지는 것이 일반적이에요.

그런데 IRES는 mRNA 내부에서 리보솜이 다시 결합할 수 있는 지점을 제공해요.

즉,

Gene A → IRES → Gene B

구조라면

Gene A 번역

↓

IRES에서 리보솜 재결합

↓

Gene B 번역

이 가능해져요.

결과적으로 하나의 mRNA에서 두 개의 단백질을 만들 수 있게 되는 거예요.

 

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IRES의 장점

가장 큰 장점은 두 단백질이 완전히 독립적인 형태로 만들어진다는 점이에요.

추가 아미노산이 붙지 않고 각각 원래 구조 그대로 발현돼요.

그래서 단백질 기능에 영향을 최소화할 수 있어요.

특히 reporter 단백질보다 기능성 단백질 자체가 중요한 경우 IRES 방식이 선호되기도 해요.

 

IRES의 단점

하지만 단점도 분명해요.

가장 큰 문제는 downstream gene의 발현량이 감소한다는 점이에요.

대부분의 경우

Gene A > Gene B

형태의 발현량을 보여요.

어떤 세포에서는 downstream 유전자의 발현이 상당히 약해질 수도 있어요.

또한 IRES 자체 길이가 상당히 길어요.

일반적으로 500~600bp 정도 되는데요.

AAV처럼 패키징 용량이 제한된 시스템에서는 부담이 될 수 있어요.

 

가장 많이 사용하는 방법 ② 2A Peptide

 

 

현재 생명과학 연구에서 가장 많이 사용되는 multicistronic 기술은 사실 IRES보다 2A peptide예요.

2A peptide는 picornavirus에서 유래한 매우 짧은 peptide 서열이에요.

보통 20개 내외의 아미노산만 필요해요.

대표적으로

T2A
P2A
E2A
F2A

가 널리 사용돼요.

구조는 매우 단순해요.

Gene A → T2A → Gene B

하나의 ORF로 연결해요.

그러면 리보솜이 번역 과정에서 특정 위치를 지나면서 peptide bond 형성을 건너뛰게 돼요.

이를 ribosomal skipping이라고 불러요.

결과적으로

Gene A 단백질

Gene B 단백질

이 분리되어 생성돼요.

 

왜 2A Peptide가 인기가 많을까?

가장 큰 이유는 발현량 때문이에요.

IRES는 downstream 발현량이 감소할 수 있지만 2A 시스템은 거의 동일한 수준으로 발현돼요.

즉

Gene A ≈ Gene B

수준의 발현을 기대할 수 있어요.

또한 크기가 매우 작아요.

T2A는 약 60bp 정도밖에 되지 않아요.

AAV 같은 벡터에서는 이 차이가 상당히 중요해요.

실제로 현재 대부분의 Cas9-GFP, CAR-T, CRISPR 시스템에서는 2A peptide가 사용되고 있어요.

 

T2A, P2A, E2A, F2A의 차이는?

실험실에서 가장 흔히 사용하는 것은 T2A와 P2A예요.

논문마다 결과는 조금씩 다르지만 일반적으로는

P2A ≈ T2A > E2A > F2A

정도의 cleavage efficiency를 보이는 경우가 많아요.

다만 세포 종류, 단백질 종류, 발현 조건에 따라 결과가 달라질 수 있어서 절대적인 기준은 아니에요.

그래서 실제로는 T2A 또는 P2A를 먼저 시도하는 경우가 가장 많아요.

 

IRES와 2A 중 무엇을 선택해야 할까?

실험 목적에 따라 달라져요.

단백질이 완전히 독립적으로 발현되어야 한다면 IRES가 유리할 수 있어요.

반면 발현량을 최대한 비슷하게 맞추고 싶다면 2A peptide가 훨씬 좋은 선택이에요.

특히 AAV나 lentivirus처럼 벡터 크기가 중요한 경우에는 대부분 2A peptide가 선호돼요.

실제로 최근에 발표되는 유전자 치료 벡터나 CRISPR 벡터를 보면 T2A가 들어간 construct를 매우 자주 볼 수 있어요.



Multicistronic vector는 하나의 mRNA에서 여러 단백질을 동시에 발현할 수 있게 해주는 강력한 분자생물학 도구예요. 특히 reporter와 관심 유전자를 함께 발현하거나, 여러 단백질의 발현 비율을 맞춰야 하는 실험에서 매우 유용해요.

현재 가장 널리 사용되는 방법은 IRES와 2A peptide이며, 최근에는 작은 크기와 높은 발현 효율 덕분에 T2A와 P2A 기반 시스템이 사실상 표준처럼 사용되고 있어요.

논문에서 "GOI-T2A-GFP" 혹은 "IRES-Puro" 같은 구조를 보게 된다면, 이제 각각이 어떤 원리로 작동하는지 훨씬 쉽게 이해할 수 있을 거예요.