shRNA란 무엇일까? CRISPR 시대에도 여전히 사용되는 RNAi 기술

 

 

유전자 기능을 연구할 때 가장 흔하게 사용하는 방법 중 하나는 특정 유전자의 발현을 줄여보는 것이에요. 해당 유전자가 사라졌을 때 세포가 어떻게 변하는지 관찰하면 그 유전자가 어떤 역할을 하는지 추론할 수 있기 때문이죠.

최근에는 CRISPR-Cas9 기술이 워낙 강력해지면서 유전자 조작의 표준처럼 사용되고 있어요. 하지만 CRISPR가 등장하기 전부터 연구자들이 오랫동안 활용해 온 유전자 억제 기술이 있어요. 바로 RNA interference(RNAi), 그리고 그 중심에 있는 shRNA예요.

실제로 지금도 수많은 논문에서 shRNA를 이용한 knockdown 실험이 진행되고 있으며, 특정 상황에서는 CRISPR보다 더 편리하게 사용되기도 해요.

 

RNAi란 무엇일까?

 

RNA interference(RNAi)는 세포가 특정 mRNA를 인식해 분해함으로써 유전자 발현을 억제하는 자연적인 방어 기전이에요.

DNA가 RNA로 전사되고, RNA가 단백질로 번역되는 과정에서 RNA 단계 자체를 제거해 버리는 방식이라고 생각하면 돼요.

즉,

DNA → mRNA → Protein

이라는 흐름에서 mRNA를 제거해 단백질 생산량을 줄이는 것이 RNAi의 핵심이에요.

RNAi에는 여러 종류의 small RNA가 사용될 수 있어요.

대표적으로는

siRNA (small interfering RNA)
shRNA (short hairpin RNA)
miRNA (microRNA)
piRNA (Piwi-interacting RNA)

등이 있어요.

이 중 연구실에서 가장 널리 사용되는 것은 siRNA와 shRNA예요.

 

shRNA는 어떻게 생겼을까?

 

shRNA는 이름 그대로 hairpin 구조를 가진 RNA예요.

양쪽에 서로 상보적인 서열이 존재하고 가운데에 loop가 들어 있어 머리핀처럼 접히는 구조를 형성해요.

간단히 표현하면

Sense sequence → Loop → Antisense sequence

형태예요.

세포 안에서 발현되면 RNA가 스스로 접혀 hairpin 구조를 만들게 돼요.

그래서 이름도 short hairpin RNA가 된 거예요.

 

shRNA는 어떻게 작동할까?

 

 

shRNA는 세포 내에 들어가면 endogenous miRNA processing pathway를 이용해 처리돼요.

가장 중요한 효소는 Dicer예요.

Dicer는 hairpin 구조를 인식한 뒤 loop 부분을 잘라내요.

그러면 약 21~22nt 길이의 siRNA duplex가 생성돼요.

이 siRNA는 이후 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합하게 돼요.

RISC는 두 가닥 중 한 가닥만 남기고 나머지 가닥은 제거해요.

남은 guide strand는 표적 mRNA를 찾아 결합하게 되고, Argonaute 단백질이 포함된 RISC가 해당 mRNA를 절단해 버려요.

결과적으로 mRNA 양이 감소하면서 단백질 발현도 감소하게 돼요.

 

shRNA와 siRNA의 차이는?

 

 

둘 다 결국 같은 RNAi pathway를 사용해요.

차이는 전달 방식에 있어요.

siRNA는 이미 완성된 RNA를 직접 세포에 넣어주는 방식이에요.

따라서 transfection 후 빠르게 효과가 나타나요.

하지만 RNA 자체가 시간이 지나면서 분해되기 때문에 효과가 오래 지속되지 않아요.

반면 shRNA는 DNA 형태의 plasmid나 viral vector를 세포에 전달해요.

세포가 지속적으로 shRNA를 생산하기 때문에 장기간 knockdown이 가능해요.

즉,

siRNA → 빠른 실험 → 일시적 knockdown

shRNA → stable cell line 제작 → 장기적인 knockdown

이라는 차이가 있어요.

 

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shRNA 벡터는 어떻게 구성될까?

일반적으로는

Promoter, shRNA sequence, Termination signal

이 포함된 구조를 가져요.

여기서 가장 중요한 것은 promoter예요.

대부분의 shRNA 벡터는 RNA polymerase III promoter를 사용해요.

대표적인 예가

U6 promoter
H1 promoter
7SK promoter

예요.

이 promoter들은 작은 RNA를 매우 강하게 발현시키는 특징이 있어요.

실제로 연구실에서 사용하는 대부분의 shRNA plasmid는 U6 promoter 기반인 경우가 많아요.

 

왜 lentivirus 기반 shRNA가 많이 사용될까?

shRNA의 가장 큰 장점은 stable knockdown cell line을 만들 수 있다는 점이에요.

이를 위해서는 shRNA cassette가 세포 게놈에 안정적으로 삽입되어야 해요.

그래서 lentiviral vector를 이용하는 경우가 많아요.

lentivirus로 감염시키면 shRNA 발현 cassette가 세포 유전체에 삽입돼요.

그 결과 세포가 분열하더라도 shRNA 발현이 계속 유지돼요.

과거에는

"유전자 기능을 확인한다"

하면

shRNA lentivirus 제작 → stable cell line 생성 → phenotype 분석

이 거의 정석적인 실험 흐름이었어요.

 

shRNA의 장점

가장 큰 장점은 사용 경험과 검증 데이터가 엄청나게 많다는 점이에요.

수십 년 동안 사용되어 왔기 때문에 대부분의 유전자에 대해 이미 검증된 shRNA sequence들이 존재해요.

또한 stable knockdown이 쉽고,

벡터 제작도 비교적 단순하며,

비용도 상대적으로 저렴한 편이에요.

특히 단백질이 완전히 없어지는 knockout보다 부분적인 감소만 필요할 경우에는 오히려 shRNA가 더 적합할 수 있어요.

 

shRNA의 한계

물론 단점도 있어요.

가장 대표적인 문제는 off-target effect예요.

guide RNA가 의도하지 않은 mRNA와 부분적으로 결합할 수 있기 때문이에요.

또한 knockdown 효율이 항상 일정하지 않아요.

어떤 경우에는 90% 이상 감소하기도 하지만,

어떤 경우에는 30~50% 정도밖에 감소하지 않을 수도 있어요.

그리고 유전자를 완전히 제거하는 것이 아니라 발현량만 감소시키는 방식이라는 점도 CRISPR knockout과의 차이점이에요.

 

CRISPR 시대에도 shRNA가 살아남은 이유

CRISPR가 등장한 이후 많은 연구가 knockout 중심으로 이동했어요.

그럼에도 불구하고 shRNA는 여전히 활발하게 사용되고 있어요.

그 이유는 간단해요.

유전자를 완전히 제거하면 세포가 죽어버리는 경우가 있기 때문이에요.

이럴 때는 완전 knockout 대신 부분적인 발현 감소가 필요해요.

또한 빠르게 후보 유전자를 스크리닝할 때도 shRNA 라이브러리는 여전히 강력한 도구예요.

실제로 대규모 기능 유전체 연구에서는 CRISPR screen과 RNAi screen이 서로 보완적으로 사용되는 경우가 많아요.

 

shRNA는 RNA interference를 이용해 특정 mRNA를 분해함으로써 유전자 발현을 감소시키는 대표적인 유전자 억제 기술이에요. 세포 내 miRNA 처리 시스템을 활용한다는 점이 특징이며, lentivirus와 결합하면 장기간 안정적인 knockdown이 가능해요.

 

CRISPR 기술이 연구 현장의 중심이 된 것은 사실이지만, shRNA는 여전히 유전자 기능 분석, stable knockdown cell line 제작, 치료용 RNAi 연구 등 다양한 분야에서 활발히 활용되고 있어요. 특히 완전 knockout보다 부분적인 유전자 억제가 필요한 경우에는 지금도 매우 강력한 선택지로 남아 있어요.