Single-cell RNA-seq이 바꿔버린 생명과학 연구, scRNA-seq 원리부터 분석까지

 

 

RNA sequencing(RNA-seq)은 지난 10여 년 동안 생명과학 연구의 표준 기술로 자리 잡았어요. 특정 조직이나 세포에서 어떤 유전자가 발현되는지 한 번에 확인할 수 있고, 질병과 정상 상태를 비교하는 데도 매우 강력한 도구죠.

그런데 기존 RNA-seq에는 한 가지 한계가 있었어요.

조직을 통째로 갈아서 RNA를 추출한다는 점이에요.

예를 들어 뇌 조직을 분석한다고 가정해볼게요. 뇌에는 뉴런만 있는 것이 아니라 astrocyte, oligodendrocyte, microglia 같은 다양한 세포들이 섞여 있어요. 기존 bulk RNA-seq은 이 모든 세포의 RNA를 한꺼번에 섞어서 분석하기 때문에 개별 세포가 가진 특성을 알 수 없어요.

평균값은 알 수 있지만 실제로 어떤 세포가 어떤 유전자를 발현하는지는 알기 어렵죠.

바로 이런 문제를 해결하기 위해 등장한 기술이 Single-cell RNA sequencing, 즉 scRNA-seq이에요.

 

Single-cell RNA-seq이란 무엇일까?

scRNA-seq은 이름 그대로 개별 세포 하나하나의 전사체(transcriptome)를 분석하는 기술이에요.

기존 RNA-seq이 조직 전체의 평균값을 보여준다면, scRNA-seq은 세포 단위의 유전자 발현 정보를 제공해요.

덕분에 같은 조직 안에서도 서로 다른 세포 집단을 구분할 수 있고, 희귀 세포(population)를 발견하거나 세포 분화 과정을 추적할 수도 있어요.

최근 발표되는 고품질 논문들을 보면 scRNA-seq 데이터가 포함되지 않은 경우가 드물 정도예요.

 

왜 Bulk RNA-seq으로는 부족했을까?

 

 

가장 큰 이유는 세포 이질성(Cellular Heterogeneity)이에요.

예를 들어 종양 조직을 생각해보면 실제 종양은 암세포만으로 구성되어 있지 않아요.

암세포
T 세포
B 세포
대식세포
섬유아세포

등 다양한 세포가 섞여 있어요.

Bulk RNA-seq에서는 이 모든 세포의 RNA가 평균화되어 나타나요.

하지만 암의 진행이나 면역반응은 특정 세포 집단에서만 일어날 수 있어요.

scRNA-seq은 바로 이 차이를 보여주는 기술이에요.

같은 종양 내부에서도 서로 다른 암세포 아형을 구분할 수 있고, 면역세포들의 활성 상태까지 확인할 수 있어요.

 

10x Genomics가 바꿔놓은 Single-cell 시장

초기 single-cell 기술은 처리 가능한 세포 수가 매우 제한적이었어요.

몇십 개, 많아야 몇백 개 수준이었죠.

지금의 scRNA-seq 시대를 연 것은 사실상 10x Genomics라고 볼 수 있어요.

10x Genomics Chromium 플랫폼은 수천 개에서 수십만 개의 세포를 동시에 분석할 수 있게 만들었어요.

현재 전 세계에서 가장 많이 사용되는 single-cell 플랫폼이기도 해요.

 

GEM이 핵심이다

 

 

10x Genomics 시스템에서 가장 중요한 개념은 GEM(Gel Bead-in-Emulsion)이에요.

원리는 생각보다 단순해요.

마이크로플루이딕 칩 안에서

단일 세포
Barcoded bead
Reverse transcription reagent
Oil

을 함께 섞어 아주 작은 액적(droplet)을 만들어요.

각 GEM 안에는 이상적으로

세포 1개
Bead 1개

가 들어가게 돼요.

세포가 GEM 내부에서 용해되면 mRNA가 방출되고, bead에 붙어 있던 barcode가 각 mRNA에 붙어요.

결국 같은 세포에서 나온 RNA들은 동일한 barcode를 갖게 되는 거죠.

 

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왜 Barcode가 중요할까?

시퀀싱이 끝나면 수억 개의 read가 생성돼요.

만약 barcode가 없다면 어떤 RNA가 어떤 세포에서 나온 것인지 알 수 없어요.

하지만 barcode 덕분에 각각의 read를 원래 세포로 되돌릴 수 있어요.

즉,

"이 유전자는 어느 세포에서 발현되었는가?"

를 알 수 있게 되는 거예요.

이것이 scRNA-seq의 핵심이에요.

 

3' assay와 5' assay

10x Genomics에는 대표적으로 두 가지 방식이 있어요.

3' Gene Expression

가장 많이 사용되는 방식이에요.

mRNA의 polyA tail을 이용해 3' 말단 부분을 읽어요.

세포 유형 분류나 DEG 분석에 적합해요.

 

5' Gene Expression

mRNA의 5' 쪽 정보를 이용해요.

특히 TCR, BCR 분석과 궁합이 좋아요.

그래서 면역학 연구에서 많이 사용돼요.

T 세포 receptor repertoire 분석이나 CAR-T 연구에서도 자주 활용돼요.

 

최근에는 FFPE도 가능해졌다

예전 scRNA-seq의 가장 큰 단점 중 하나는 살아있는 세포가 필요하다는 점이었어요.

조직을 분리하는 과정에서 RNA 품질이 떨어질 수도 있었고요.

최근에는 Flex Gene Expression 기술이 등장하면서 상황이 많이 바뀌었어요.

이 기술은

Frozen tissue
Fixed sample
FFPE tissue
Whole blood

등 다양한 샘플에서도 분석이 가능해졌어요.

특히 임상 샘플 연구에서 활용도가 크게 증가하고 있어요.

 

분석은 어떻게 할까?

시퀀싱이 끝났다고 결과가 뚝딱 나오는건 아니에요.

오히려 여기서부터 시작이에요.

10x Genomics에서는 Cell Ranger라는 분석 파이프라인을 제공해요.

Cell Ranger가 수행하는 대표적인 작업은

Read mapping
Cell barcode identification
UMI counting
Expression matrix 생성

이에요.

이후 Seurat, Scanpy 같은 분석 툴을 이용해

Clustering
UMAP
t-SNE
Differential expression
Trajectory analysis

등을 수행하게 돼요.

최근 single-cell 논문 Figure를 보면 거의 대부분 UMAP plot이 등장하는 이유가 바로 여기에 있어요.

 

어떤 연구에 많이 사용할까?

현재 scRNA-seq은 거의 모든 생명과학 분야에서 사용되고 있어요.

신경과학에서는 특정 뉴런 집단을 구분하고 발달 과정을 추적해요.

암 연구에서는 종양 미세환경(TME)을 분석하고 면역세포 구성을 확인하죠.

면역학에서는 T 세포 활성화 과정과 면역 반응을 분석해요.

줄기세포 연구에서는 세포 분화 과정을 시간 순서대로 재구성하기도 해요.

최근에는 organoid 연구에서도 scRNA-seq이 사실상 필수 분석 도구처럼 사용되고 있어요.



Single-cell RNA sequencing은 "평균"만 보여주던 기존 RNA-seq의 한계를 극복한 기술이에요. 같은 조직 안에서도 개별 세포 수준의 유전자 발현을 분석할 수 있기 때문에 세포 이질성, 희귀 세포 집단, 분화 과정, 질병 진행 메커니즘 등을 훨씬 정밀하게 이해할 수 있게 되었죠.

특히 10x Genomics의 Chromium 플랫폼 등장 이후 분석 가능한 세포 수가 폭발적으로 증가하면서 scRNA-seq은 특정 연구 분야의 기술이 아니라 현대 생명과학 연구의 핵심 플랫폼으로 자리 잡았어요.

요즘 Nature, Cell, Science 계열 논문을 보면 scRNA-seq 데이터가 없는 경우가 오히려 드물 정도예요. 그만큼 생명과학 연구에서 세포 하나하나를 바라보는 시대가 본격적으로 시작되었다고 볼 수 있어요.