Cell Synchronization이란? Double Thymidine Block부터 Nocodazole 처리까지 완벽 정리

 

 

세포주를 이용해 실험하다 보면 한 번쯤은 이런 고민을 하게 돼요.

"지금 내 세포들은 모두 같은 상태일까?"

실제로 배양 중인 세포들은 모두 같은 세포주라고 해도 서로 다른 세포주기(Cell Cycle) 단계에 존재해요. 어떤 세포는 DNA를 복제하고 있고, 어떤 세포는 막 분열을 끝냈으며, 또 다른 세포는 곧 분열을 시작하려고 준비 중일 수도 있죠.

문제는 세포주기와 관련된 단백질이나 신호전달 경로를 연구할 때 이런 불균일성이 실험 결과를 흐리게 만들 수 있다는 점이에요.

그래서 연구자들은 세포들을 특정 세포주기 단계에 모아놓는 작업을 수행하는데, 이를 Cell Synchronization(세포 동기화)이라고 불러요.

오늘은 Cell Synchronization의 원리와 대표적인 방법들, 그리고 실험실에서 가장 많이 사용하는 Double Thymidine Block과 Nocodazole 처리법에 대해 알아보려고 해요.

 

Cell Synchronization이란 무엇일까?

 

 

Cell Synchronization은 배양 중인 세포들을 동일한 세포주기 단계에 맞추는 기술이에요.

예를 들어 모든 세포를 G1/S 경계에 정지시키거나, M phase에 모아둘 수 있어요.

이렇게 하면 특정 세포주기 단계에서 일어나는 현상을 보다 명확하게 분석할 수 있어요.

실제로 세포주기 관련 연구에서는 거의 필수적으로 사용되는 기술 중 하나예요.

특히

Cyclin 연구
CDK 연구
DNA replication 연구
Mitosis 연구
Cell cycle checkpoint 연구

에서는 매우 자주 활용돼요.

 

왜 Cell Synchronization이 필요할까?

만약 아무 처리도 하지 않은 세포를 수집해서 Western blot을 진행한다고 생각해볼게요.

배양 접시 안에는

G1 phase 세포
S phase 세포
G2 phase 세포
M phase 세포

가 모두 섞여 있어요.

결국 특정 단계에서만 발현되는 단백질은 희석되어 보일 수밖에 없죠.

반면 Synchronization을 수행하면 대부분의 세포가 같은 단계에 위치하게 돼요.

덕분에 세포주기 의존적인 변화들을 훨씬 명확하게 관찰할 수 있어요.

 

세포주기의 기본 구조

Cell Synchronization을 이해하려면 먼저 세포주기를 알아야 해요.

세포주기는 크게 네 단계로 구성돼요.

G1 Phase

세포가 분열을 마친 뒤 다음 분열을 준비하는 단계예요.

세포 성장과 단백질 합성이 활발하게 일어나죠.

S Phase

DNA 복제가 진행되는 단계예요.

세포가 자신의 유전정보를 복사하는 과정이라고 생각하면 돼요.

G2 Phase

DNA 복제가 완료된 후 분열 직전까지의 준비 단계예요.

손상된 DNA가 없는지 확인하는 과정도 이루어져요.

M Phase

실제로 염색체가 분리되고 세포가 둘로 나뉘는 단계예요.

우리가 흔히 말하는 Mitosis가 여기에 해당해요.

 

Cell Synchronization 방법은 크게 두 가지

Cell Synchronization은 크게 화학적 방법과 물리적 방법으로 나눌 수 있어요.

 

Chemical Blockade

가장 많이 사용하는 방법이에요.

특정 약물을 처리해 세포주기의 특정 단계에서 세포를 정지시키는 방식이죠.

대표적인 약물로는

Thymidine
Hydroxyurea
Nocodazole
Taxol
RO-3306

등이 있어요.

실험실에서 가장 흔한 방법도 바로 이 Chemical Blockade예요.

 

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Physical Fractionation

세포를 물리적으로 분리하는 방법이에요.

대표적으로

Density gradient centrifugation
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorting)

등이 사용돼요.

특히 Flow cytometry를 이용하면 DNA 함량에 따라 세포를 분리할 수 있어요.

다만 장비가 필요하고 과정이 복잡하기 때문에 일반적으로는 화학적 동기화가 더 많이 사용돼요.

 

Double Thymidine Block이 가장 유명한 이유

Cell Synchronization을 이야기할 때 가장 먼저 등장하는 것이 Double Thymidine Block이에요.

줄여서 DTB라고 부르기도 해요.

Thymidine을 과량 처리하면 DNA 합성이 억제되면서 세포들이 G1/S 경계에 정지하게 돼요.

그런데 한 번만 처리하면 완벽하게 동기화되지 않는 경우가 많아요.

그래서

1차 Thymidine 처리
Release
2차 Thymidine 처리

를 수행하는 Double Thymidine Block이 널리 사용돼요.

이 방법은 HeLa, HEK293, U2OS, K562 같은 다양한 세포주에서 매우 높은 동기화 효율을 보여요.

 

Nocodazole은 왜 사용할까?

M phase 연구를 하는 사람이라면 Nocodazole을 자주 사용해요.

Nocodazole은 microtubule 형성을 억제하는 약물이에요.

세포가 염색체를 분리하기 위해서는 방추사(spindle)가 필요해요.

그런데 Nocodazole이 이를 방해하면서 세포는 M phase에 멈추게 돼요.

그래서

Mitotic protein 연구
Chromosome segregation 연구
Mitotic checkpoint 연구

에서 매우 자주 사용돼요.

실제로 논문을 보면 "cells were synchronized in mitosis by nocodazole treatment"라는 문장을 흔히 볼 수 있어요.

 

RO-3306은 어떤 약물일까?

최근 Cell Cycle 연구에서 많이 사용되는 약물 중 하나가 RO-3306이에요.

이 약물은 CDK1을 선택적으로 억제해요.

CDK1은 G2에서 M phase로 진입하는 데 필수적인 단백질이에요.

따라서 RO-3306을 처리하면 세포들이 G2/M 경계에 정지하게 돼요.

Mitosis 직전 단계만 보고 싶은 연구자들이 자주 사용하는 방법이에요.

 

Serum Starvation도 Synchronization 방법일까?

의외로 많은 연구실에서 사용하는 방법이에요.

세포를 serum이 없는 배지에서 일정 시간 배양하면 세포들이 증식을 멈추고 G0/G1 phase에 축적돼요.

이후 serum을 다시 공급하면 세포들이 거의 동시에 세포주기를 재개하게 돼요.

방법이 간단하고 비용이 적게 든다는 장점이 있지만 세포주에 따라 반응 차이가 큰 편이에요.

 

Synchronization은 어떻게 확인할까?

동기화가 제대로 되었는지 확인하지 않으면 의미가 없어요.

가장 널리 사용되는 방법은 Flow Cytometry예요.

세포를 고정한 후 Propidium Iodide(PI)로 DNA를 염색하면 DNA 함량을 측정할 수 있어요.

그러면

G1 population
S phase population
G2/M population

을 구분할 수 있죠.

Double Thymidine Block 후에는 G1/S 경계에 세포가 집중된 패턴이 나타나고, Nocodazole 처리 후에는 G2/M population이 크게 증가하는 것을 확인할 수 있어요.

그래서 논문에서도 Synchronization 검증은 대부분 FACS 데이터를 함께 제시해요.

 

Cell Synchronization은 세포주기 연구에서 가장 기본적이면서도 중요한 기술 중 하나예요. Double Thymidine Block은 G1/S 경계 동기화에, Nocodazole은 M phase 동기화에, RO-3306은 G2/M arrest에 널리 사용되고 있죠.

세포주기 관련 단백질이나 신호전달 경로를 연구한다면 Synchronization은 거의 필수적인 과정이라고 할 수 있어요. 같은 세포주라도 어떤 단계에 있는 세포를 분석하느냐에 따라 결과 해석이 완전히 달라질 수 있기 때문이죠.