[루시페레이스] 4편 : 루시페레이스 리포터 플라스미드 설계 A to Z

 

 

 

루시페레이스 리포터 어세이를 준비할 때 가장 먼저 고민할 것은 ‘어떤 리포터 플라스미드를 사용할 것인가’예요. 

 

 

플라스미드의 구조와 프로모터 선택에 따라 실험 결과가 완전히 달라질 수 있기 때문에, 실험 목적에 맞게 정확한 설계가 필요해요. 이번 글에서는 루시페레이스 리포터 플라스미드의 구성 요소와 설계 팁, 그리고 측정 전 확인해야 할 포인트를 알려드릴게요.

루시페레이스 리포터 플라스미드의 기본 구성

 

 

루시페레이스를 발현하는 플라스미드는 보통 다음과 같은 구조로 되어 있어요.

 

프로모터 (Promoter)

유전자의 전사 활성을 유도하는 요소로, 실험 목적에 따라 다양하게 선택 가능해요. 예를 들어, CMV나 SV40 같은 강력한 상시 발현 프로모터도 있고, 특정 반응성 엘리먼트를 넣은 유도성 프로모터도 있어요.

루시페레이스 유전자 (Luciferase ORF)

Firefly, Renilla, NanoLuc 중 하나의 루시페레이스 유전자가 들어가며, 경우에 따라 dual-reporter 형식으로 두 가지 루시페레이스를 함께 담기도 해요.

polyA 신호 (Polyadenylation signal)

mRNA의 안정성과 번역을 돕는 요소예요.

항생제 저항성 유전자 및 원형복제 시작점 (Ori)

플라스미드를 증폭하고 선별하기 위한 기본 요소들로, 실험에서의 기능과 직접적인 관련은 없지만 필수적인 구조예요.

 

실험 목적에 맞춘 설계 전략

루시페레이스 어세이는 유전자 발현 조절, 프로모터 활성을 정량화하거나, 특정 신호전달 경로의 활성 여부를 판단하는 데 주로 사용돼요. 따라서 어떤 반응 엘리먼트를 리포터 앞에 넣느냐가 실험의 핵심이 됩니다.

 

NF-κB, p53, CRE 등 반응성 엘리먼트: 특정 세포 반응을 측정하고 싶다면, 해당 경로와 관련된 엘리먼트를 리포터 앞에 배치해서 유도성 리포터를 만들 수 있어요.

전사인자 활성을 측정할 때는 해당 전사인자의 결합 서열을 프로모터 앞에 삽입하고, 이를 통해 루시페레이스 신호를 통해 활성도를 간접적으로 측정할 수 있죠.

또한, 이중 루시페레이스 시스템을 이용하면 실험 간 세포 수나 트랜스펙션 효율의 차이를 보정할 수 있어요. 하나는 실험군(예: Firefly luciferase), 다른 하나는 내재적 대조군(예: Renilla luciferase)으로 사용하면 정량성이 높아져요.

 

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루시페레이스 측정 전 체크리스트

세포 상태 확인

세포가 건강하지 않으면 발광량이 낮고, ATP가 불안정해서 신뢰성 있는 결과가 어렵습니다.

 

기질 준비

Firefly는 D-Luciferin, Renilla는 Coelenterazine, NanoLuc은 Furimazine이 필요해요. 각 효소에 맞는 기질을 잘 준비해야 하고, 혼동하지 않도록 주의해야 해요.

측정 시간

일부 루시페레이스는 발광이 빠르게 사라지기 때문에, 기질을 넣은 후 메뉴얼에서 권장하는 시간 이후에 바로 측정하는 것이 중요합니다.

배경 신호 최소화

백그라운드 발광이 발생할 수 있으므로, 무처리군을 반드시 포함해 기준을 설정해 주세요.

중복 처리

기술 복제를 꼭 3회 이상 해주는 것이 통계적으로 안정적인 결과를 얻는 데 도움이 됩니다.

 

루시페레이스 실험, 설계부터 분석까지 전략적으로

루시페레이스 리포터 어세이는 단순한 빛 측정이 아니라, 잘 설계된 벡터와 실험 전략이 만나야 정확한 결과를 얻을 수 있어요. 

 

 

실험 전에는 플라스미드의 구조를 꼼꼼히 확인하고, 어떤 조건이 실험에 가장 잘 맞는지를 충분히 고민해야 해요. 특히 실험 목적에 따라 프로모터, 반응성 엘리먼트, 루시페레이스 종류를 고르는 안목이 점점 더 중요해지고 있답니다.