놀면서 공부하기

이전 포스트에는 주로 initiation 과정에 대해 살펴봤고, 그 중에서도 sigma factor가 어떤 역할을 하는지를 특히 중점적으로 살펴보았음. 지금부터는 sigma factor 그 자체의 구조에 대해 조금 더 살펴보자. 위 그림은 각종 sigma factor의 amino acid sequence를 나타내고 있음. 이 때 이들이 공통적으로 가지는 특징적인 region이 있어서 각각 1, 2, 3, 4로 이름붙임. 그 중에서도 2, 4는 대부분의 sigma factor에서 보존되어 있음을 확인 가능함. (2, 4 region이 대부분의 sigma factor에서 conserve되어 있다는 것은, 이 region이 그만큼 핵심적 역할을 할 것이라는 것을 암시함) 지금부터 E. coli가 가지고 있는 ..

저번 포스트에 이어서 이번 포스트에서는 원핵생물 전사 개시에서 중요한 개념 중 하나인 promoter clearance라는 개념에 대해 알아보자. 이 개념은 RNA polymerase가 promoter에 한 번 붙은 후 elongation을 위해 promoter와 다시 떨어져 앞으로 나가는 과정을 의미함. (그런데 이 때 한 번에 확 앞으로 나간다기보다는, 일종의 주춤거림이 발생하게 되는데 이 주춤거림에 의해 앞서 살펴본 abortive transcript가 생김) 그렇다면 promoter clearance는 어떤 식으로 일어나는 것일까. 이에 대한 3가지 가설이 있음. 첫 번째 가설은 transient excursion으로, 말 그대로 조금 downstream으로 내려갔다가 다시 조금 upstream으..

이번 포스트에서는 저번 포스트에 이어서 원핵생물의 전사개시 과정에 대해 알아보자. 지난 포스트의 마지막에서는 sigma factor가 다시 재사용되기 위해 거치는 sigma cycle에 대해 알아봤었음. 그렇다면 sigma-cycle은 어떻게 일어날까. 이와 관련된 가설이 두 가지 존재함. 첫 번째는 obligate release 가설이고 두 번째는 stochastic release 가설임. 첫 번째 가설은 initiation이 일어나자마자 sigma factor가 바로 떨어져버린다는 것이고 두 번째 가설은 시기에 상관없이 random하게 sigma factor가 떨어진다는 것임. 현재는 두 번째 가설이 학계에서 더 인정받고 있는 상황임. 그렇다면 이러한 가설들에 대한 검증은 어떤 방식으로 이루어졌을까...

이번 포스트부터는 원핵생물에서의 transcription initiation(전사 개시) 과정에 대해 자세히 알아보자. 과거에 Carpousis와 Gralla는 전사 개시 시점에서 매우 작은 크기의 oligonucleotides(2~6 nucleotide long)가 만들어지는 것을 관찰함. 이러한 작은 조각에 해당하는 oligonucleotide들을 abortive transcript라고 부름. (최대 10bp 길이로까지 발견) 위 그림에서 1은 DNA를 아예 넣어주지 않은 것이고, 2~7은 시간 순서대로 RNA polymerase에 의해 만들어지는 transcript의 크기를 측정해 본 것임. (이 때 heparin이라는 물질을 넣어서 RNA polymerase가 두 번 이상 사용되지 못하게 만들어줌..

이번 포스트에서는 세균을 포함한 원핵세포에서 일어나는 RNA 전사에 있어서 매우 중요한 역할을 수행하는 RNA polymerase와 promoter에 대해 알아보자. RNA polymerase (RNA 중합효소) 원핵생물이 사용하는 RNA polymerase의 물성에 대해 SDS-PAGE를 통해 처음으로 밝혀낸 것은 1969년의 일임. 그 당시의 SDS-PAGE 결과는 아래와 같음. 이 때 이 실험 결과를 통해 한 polypeptide로 구성된 줄 알았던 RNA polymerase가 실제로는 alpha, beta, beta', sigma의 subunit(소단위체)들로 이루어져 있음을 알 수 있었음. 한편, 다른 실험을 통해 이 밖에 omega 소단위체도 존재함이 밝혀짐. 이 때 alpha, beta로만 ..

이번 포스트에서는 knockout(낙아웃)과 transgene에 대해 알아보자. knockout mice는 특정 gene을 turn-off시킨 mice이고, transgenic mice는 외부로부터 특정 gene을 추가해서 (주로) gain-of-function(획득형질)시킨 mice임. 그렇다면 knockout mice는 어떻게 만들까. 우선, 우리가 원하는 부위에 돌연변이가 생긴 유전자를 생산해내야 함. 이를 위해 위 그림에 나타나 있는 것과 같은 과정들이 사용됨. 위 그림 맨 위에서부터 순서대로 살펴보자. 우선 우리가 target으로 하는 gene이 삽입된 vector를 준비함. 이 vector에는 그림상에서 파란색으로 표시된 tk(thymidine kinase) marker도 포함되어 있음. 한편..

이번 포스트에서는 단백질, 단백질간의 상호작용에 대해 알아보기 위해 사용 가능한 방법들에 대해 알아보자. IP (immunoprecipitation, 면역침강법) 단백질과 단백질간의 상호작용을 보는 가장 손쉬운 방법 중 하나는 immunoprecipitation을 이용하는 것임. A와 B가 서로 결합하는지 여부를 확인하기 위해서 X에 붙는 (무거운 bead가 달린) 항체를 사용해서 X를 침강시켜줌. 이 때 가라앉은 침전물에 Y가 있는지를 western blot으로 확인할 수 있음. (이를 위해 Y에 붙는 antibody를 probe로 사용) 결과적으로 만약 X에 대한 항체를 이용해 IP를 수행한 이후 침전물에 A가 같이 검출된다면 A와 B는 서로 결합한다는 결론을 내릴 수 있음. yeast two-hyb..

이번 포스트에서는 DNA와 단백질간의 상호작용을 살펴보고자 할 때 사용가능한 실험방법들에 대해 알아보자. nitrocellulose filter binding assay 이 방식에서는 위 그림과 같이 DNA는 통과 가능하지만 protein은 통과 불가능한 filter를 사용함. 이 때 우리가 내용물의 양을 어느 정도 알고 있는 labeled DNA와 protein의 혼합물을 이 filter를 통해 부어줬을 때 만약 DNA와 protein이 서로 결합하여 상호작용한다면 protein과 붙은 DNA는 filter를 통과하지 못하고 남아있을 것임. 따라서 filter를 통과한 DNA의 양과 filter를 통과하지 못한 DNA의 양을 측정하면 DNA와 특정 protein간의 affinity(결합력) 정도를 확인..

이전 포스트에서는 in vitro 상황에서 transcription 정도를 측정하는 방법에 대해 살펴봤었음. 이제 in vivo 상황, 즉 세포 내에서 전사의 정도를 측정하는 방법들에 대해 살펴보자. 우선 in vivo에서 이를 측정하면 어떤 장점이 있을까. 일단 transcript는 synthesis(합성)될 뿐 아니라 degradation(분해)되기도 함. 그러나 in vitro 상황에서의 실험은 대부분 synthesis만 측정 가능함. 반면 in vivo 상에서의 측정 시 synthesis와 degradation이 더해진 진짜 발현양을 알 수 있음. nuclear run-on transcription 이 방법의 경우 세포 내의 핵을 실제로 분리한 다음, 그 핵 안에서 일어나는 전사의 정도를 측정하는..

이번 포스트에서는 전사체(transcript, RNA)를 분석할 때 사용 가능한 각종 분석 방법들에 대해 알아보자. nothern blot (노던 블랏, 노던 블롯, 노던 블로팅) 우선 nothern blot에 대해 알아보자. 이 방식은 서던 블롯과 매우 유사하지만 실험 대상이 RNA라는 점만 다름. 우선 다양한 조직들로부터 RNA를 얻은 후 RNA를 gel에 loading한 다음 서던 블롯에서와 동일한 방법으로 membrane으로 옮겨줌. 이후 우리가 관찰하고자 하는 RNA가 어느 정도 존재하는지를 보아야 하므로 probe(탐침)를 써야 하는데, 이 때는 일반적으로 우리가 관심있는 RNA에 상보적으로 결합할 수 있는 cDNA를 probe로 사용함. 이후 autoradiograph 등을 이용하면 위 그림..