이전 포스트에서는 in vitro 상황에서 transcription 정도를 측정하는 방법에 대해 살펴봤었음. 이제 in vivo 상황, 즉 세포 내에서 전사의 정도를 측정하는 방법들에 대해 살펴보자.
우선 in vivo에서 이를 측정하면 어떤 장점이 있을까. 일단 transcript는 synthesis(합성)될 뿐 아니라 degradation(분해)되기도 함. 그러나 in vitro 상황에서의 실험은 대부분 synthesis만 측정 가능함. 반면 in vivo 상에서의 측정 시 synthesis와 degradation이 더해진 진짜 발현양을 알 수 있음.
nuclear run-on transcription
이 방법의 경우 세포 내의 핵을 실제로 분리한 다음, 그 핵 안에서 일어나는 전사의 정도를 측정하는 실험방법에 해당함.
위 그림과 같이 분리된 핵 내에서는 이미 계속 전사가 일어나고 있을 것임. 그런데 여기에 특정 시점부터 32P-NTP를 넣어주게 되면 그 때부터 합성되는 transcript는 모두 표지될 것임. (그 시점에서 active한 gene이 누구인지 파악 가능) 이후 이 때 만들어진 전사체들을 (b)와 같이 dot blot assay시켜주면 여러 gene 중 어떤 gene이 특정 조건에서 많이 발현되고 있는지에 대한 정보를 얻을 수 있음.
이 때 dot blot assay는 gene이 포함된 DNA들을 바닥에 깔아두고, 전사체들을 위에 뿌려서 어느 곳에 labeled RNA가 많이 존재하는지를 확인하는 방법임. 이 방법을 이용하면 점의 신호 세기를 이용해서 각 gene 별 transcription 정도를 정량하는 것도 가능함.
reporter gene transcription
일반적으로 gene의 발현 정도는 promoter(프로모터)에 의해 결정됨. 따라서 어떤 gene의 발현 정도를 알아보고 싶다면 gene 앞에 붙은 promoter를 땐 다음, 발현량을 손쉽게 시각화할 수 있는 reporter gene 앞에 붙여준 후 발현을 시켜보는 전략을 사용하게 됨.
이 때 흔히 사용되는 reporter gene 중 대표적인 것 3가지가 있는데, 하나하나 알아보자.
우선 lacZ gene을 사용할 수 있음. lacZ gene은 앞서 살펴본 것처럼 발현 시 beta-galactosidase를 만들게 되는데, 이 때 X-gal과 함께 이 녀석을 넣어줄 시 X-gal이 분해되어 파란색이 보임. 이 파란색의 정도로 gene expression 정도를 파악할 수 있음.
다음으로 luciferase gene을 사용할 수 있음. 이 gene으로부터 만들어지는 Luciferase는 Luciferin을 잘라서 형광을 띄게 해주므로, 형광 정도를 바탕으로 gene expression 정도를 파악할 수 있음.
마지막으로 cat gene을 사용할 수 있음. 이와 관련된 모식도가 아래 그림에 나타나 있음.
cat gene으로부터 발현되는 enzyme은 chloramphenicol acetyl transferase(CAT)임. 이 녀석은 쉽게 말해 acetyl기를 전이시켜주는 녀석임.
실제로 cat gene과 특정 promoter를 재조합한 후 넣어준 뒤 세포 내에서 합성된 단백질 성분을 세포로부터 추출함. 이후 이 추출물에 14C-CAM(표지가 이루어진 CAT의 기질)과 acetyl-CoA(acetyl기를 제공하는 역할)를 넣어줌. 그러면 결국 CAT의 양 만큼 14C-CAM의 acetylation이 일어날 것임.
이후 thin-layer chromatography를 수행하고 autoradiography로 관찰하게 되면 위 그림의 맨 아래에 나와있는 것과 같은 결과를 얻을 수 있음. 이 때 맨 아래쪽에 나와있는 검은 band는 14C-CAM 그 자체의 band이며, 4~7 sample에 걸쳐서 나오는 조금 더 위 쪽의 band는 14C-CAM이 acetylation된 결과 나타나는 band임. (이 때 맨 위에 있는 band는 acetylation이 2번, 그 아래에 있는 band는 acetylation이 1번 일어난 것에 해당함) 이를 통해 4~7번 sample 조건에서 가장 gene이 많이 발현하고 있다는 것을 알 수 있음. (즉, 이 조건에서의 promoter 활성이 가장 높다고 볼 수 있음)
다음 포스트에서는 DNA와 단백질간의 상호작용에 대해 분석할 수 있는 여러 방법들에 대해 알아보자.