[분자생물학] 22.2 : bacteria에서의 재조합 기작 - 1

 

 

이번 포스트부터는 bacteria에서 일어나는 재조합 기작에 대해 알아보도록 하자.

 

 

 

 

 

위 그림에는 bacteria(그 중에서도 E. coli)에서 일어나는 recombination의 mechanism이 나타나 있음. 이에 대해서 하나하나 알아보자.

 

 

 

 

처음에는 5'-GCTGGTGG-3'으로 구성된 Chi-site라는 곳을 기점으로 RecBCD의 DNA helicase activity가 작용해서 unwinding 작용이 일어남. (즉, Chi-site가 bacterial recombination의 initiation site임) 한편 RecBCD는 ss-endonuclease activity도 있어서 이 녀석에 의해서 결과적으로 5' resection이 일어나고 그 결과 3' strand가 형성됨.

 

 

 

 

 

위 그림의 오른쪽에 RecBCD가 나타나 있음. 일단 Chi site를 만나기 전에는 위 그림의 왼쪽 위에 나타난 것과 같이 D의 unwinding activity를 바탕으로 RecBCD가 쭉 scanning을 해나가고 있음. 그러던 중 C에 의해서 Chi site가 인지되게 되면 C에 의해 D의 활성이 stop되고, 그 자리에서 RecBCD가 stall되어있게 됨. 그 상태에서 D에 의해 B가 활성화되고, 그 결과 B가 nuclease 활성을 바탕으로 Chi site 부위를 끊어줌과 동시에 B의 helicase 활성을 이용해서 끊긴 부분을 벌려주기도 함. 동시에 B는 RecA라는, ssDNA에 binding되어 protector 역할을 해주는 녀석을 loading시켜주게 되고 결과적으로 RecA coating된 3' overhang이 만들어지게 됨.

 

 

 

 

그 다음에는 이제 D loop가 형성되는 pathway가 이어짐. RecA가 coating된 ssDNA는 다른 dsDNA 주변을 searching하며 ssDNA와 homology를 보이는 서열을 찾게 됨. 그러다가 homology가 있는 서열을 만나게 되면 이 부분으로 invading이 일어나면서 결과적으로 D(displacement) loop를 형성하게 됨. 그러면 이렇게 invading된 ssDNA에 의해 결국 빨간 부분의 DNA도 끊어지게 됨. (위 그림 맨 아래) 아마 붉은 가닥에 gap이 생기는 과정에서도 RecA가 관여하는것으로 보임.

 

 

 

 

그 다음에는 위 그림에서도 나타난 것과 같이 ligase에 의해 두 가닥이 서로 교차된 채로 다시금 이어지게 됨. 이 때 생기는 교차된 junction을 holliday junction이라고 부름. 한편 이후 RuvA, RuvB에 의해서 이 holliday junction이 오른쪽 부분으로 migration되는데, 이 과정에서는 RuvA, B의 ATP-dependent helicase activity가 매우 중요하게 작용함. (helicase에 의한 unwinding이 필요한 이유가 무엇일까. 위 그림상에서 윗 가닥 두 개, 아랫가닥 두 개가 결국 다 상보적으로 결합되어있는 상태이므로 이 때 migration을 시키려면 unwinding이 필수적이기 때문임) 이후 결국 RuvC에 의해서 crossover resolution 혹은 noncrossover resolution이 일어나게 됨. 이 때 이 둘의 차이는 holliday junction을 위아래로 잘랐는지, 좌우로 잘랐는지에 달려있음. 이에 대해서는 이후 다시금 자세하게 살펴볼 것임.

 

 

 

 

 

다음으로 RecBCD의 activity와 관련된 구체적인 실험결과에 대해 살펴보도록 하자.

 

 

우선 왼쪽의 결과부터 살펴보자. 이 경우 in vitro 환경에서 DNA와 함께 RecBCD를 넣어봤을 때 RecBCD 활성에 의해 잘린 fragment가 관찰되는지를 확인한 것임.

 

 

특별히 이 경우에는 3' 말단에 labeling이 된 DNA를 사용함. 이 때 실험 결과를 살펴보면 Chi site를 넣어주지 않은 경우인 lane 2에서는 RecBCD를 넣어줘도 잘려진 product가 나타나지 않음. 한편 Chi site가 있고 RecBCD를 넣어준 lane 4에서는 잘려진 product가 나타남. 이런 product가 나타나는 이유는 Chi site 부근이 RecBCD에 의해 잘린 후, 마찬가지로 RecBCD가 가진 helicase 활성에 의해서 잘린 조각이 바깥으로 release되는 것이 가능하기 때문임. 한편 lane 6을 보면 boiling을 시켜주지 않았는데도 Chi site와 RecBCD의 존재만으로 잘려진 조각이 나타남. 이를 통해서 boiling 없이도 RecBCD만으로 잘려진 DNA를 분리시킬 수 있는 활성을 가지고 있다는 것을 알 수 있음.

 

(참고로 1, 2, 3, 4 lane의 경우에는 마지막 step에서 boiling을 가해줌)

 

다음으로 위 그림 오른쪽의 결과를 살펴보자. 이 경우 in vivo에서 RacBCD dependent한 strand exchange가 얼마나 되는지를 확인함. 이 때 x축은 시간, y축은 exchange 정도를 의미함.

 

 

결과를 보면 RecA, RecBCD를 다 안 넣어준 경우에는 exchange가 일어나지 않음. 한편 RecBCD, RecA를 다 넣어준 red line의 경우에는 exchange가 잘 일어남. 한편 RecA를 먼저 넣어준 후 뒤늦게 RecBCD를 넣어준 경우에는 RecBCD를 넣어주기 전까지는 exchange가 잘 안일어나다가 RecBCD를 넣어준 시점부터 exchange가 활발하게 일어남. 마지막으로 RecA와 함께 heat을 가해서 DNA를 denaturation시켜준 경우인 남색을 보면 빨간색과 비슷하게 exchange가 잘 일어남을 확인할 수 있음. 이는 heat에 의한 DNA denaturation 효과가 RecBCD에 의한 효과(즉, unwinding)를 modify할 수 있음을 암시함. 즉, heat에 의해 DNA가 벌어지게 되면 이곳에 RecA가 붙은 후 crossover가 일어나서 남색과 같은 결과가 나타난 것임.

 

 

그러면 RecA는 구체적으로 어떤 역할을 하는 것일까. RecA는 아래 그림에 표현되어 있는 presynapsis, synapsis, postsynapsis의 과정에서 다 관여함.

 

 

 

 

일단 접합이 일어나기 전인 pre-synapsis 과정에서는 RecA가 ssDNA binding 활성을 바탕으로 ssDNA를 coating함. 이 coating은 ssDNA가 secondary structure를 만들지 못하게 해서 궁극적으로는 exchange에 이은 invasion이 더 잘 일어날 수 있도록 도와줌.

 

 

이후 synapsis 과정에서는 strand exchange가 일어날 수 있도록 해줌. 즉, complementarity가 있는 ssDNA와 dsDNA 사이의 인지에 이은 결합이 일어나도록 해줌. 참고로 synapsis에서는 아직 접합만이 일어나 있음. 즉, 신장은 일어나지 않고 있는 상황임.

 

 

 

 

위 그림에 여러 synapsis 상황이 묘사되어 있으므로 참고할 것.

 

그리고 post-synapsis 과정에서는 ssDNA가 dsDNA 중 일부를 비집고 들어간 채로 점차 신장되어가며 replace가 될 수 있도록 해줌. 이 과정에서 원래 결합하고 있었던 dsDNA 사이를 벌려서 새로운 ssDNA가 침투할 수 있도록 도와줌. 이 과정에서는 지속적인 replace가 일어나는데, 이 말인즉슨 새로운 DNA 가닥이 계속 합성됨. 이렇게 되면 이제 궁극적으로 D-loop가 형성되게 되는 것임.

 

 

 

 

 

위 그림에 나타난 표를 보면 RecA가 D-loop 형성에 얼마나 중요한지를 알 수 있음. 일반적으로 모든 element들이 다 있을때는 100%의 D-loop가 형성되는데, RecA가 없거나 ATP가 없거나, 인산화가 안되는 ATPgammaS만 있는 경우에는 D-loop가 1% 이하로 형성된다는 것을 알 수 있음.

 

 

이를 통해 알 수 있는 것은 D-loop 형성에 RecA가 상당히 중요한 역할을 한다는 것이며, 이 밖에 가수분해가 가능한 ATP가 있어야만 D-loop의 형성이 잘 이루어진다는 것을 알 수 있음.

 

 

이후 여러 실험들을 통해 postsynapsis 과정에서 RecA가 떨어져나가야 지속적인 strand의 신장이 가능해져서 D-loop가 만들어질텐데, 이 때 RecA가 떨어져나가기 위해서 ATP의 가수분해가 필요하다는 것을 알게 됨. (물론 그 이전에 dsDNA와 ssDNA간의 strand exchange가 일어나기 위해서는 RecA와 ATP 그 자체가 필요하기도 함)

 

 

한편 RecA가 D-loop 형성에 중요하고 결과적으로 strand exchange에 중요하다는 사실을 이용해서 의도적으로 RecA mutant를 사용하기도 함. 예를 들어 cloning E. coli의 경우 비슷비슷한 genome을 가지고 있는 경우가 많은데, 이들 배양 과정에서 비슷한 genome끼리의 homology에 의해 HR이 일어나버리면 우리가 원하는 gene이 없어지거나 기능을 잃어버릴수도 있음. 그렇기 때문에 주어진 gene의 stability를 높이기 위한 용도로 RecA mutant를 많이 사용해줌.

 

 

이 밖에 아예 stable한 E. coli를 써주는 경우도 있음. 예를 들어 LTR 등이 포함되어 있어서 서열들이 다 비슷비슷한 경우라면 RecA mutant만으로도 역부족일 수 있음. 이런 경우 stable한 E. coli를 써주면 됨. 이 밖에 아예 온도를 낮춰서 HR이 일어날 chance를 낮춰주는 방식도 general하게 많이 사용됨.

 

 

다음 포스트에서 이어서 살펴보자.