이번 포스트에서는 저번 포스트에 이어 나머지 translation initiation factor들에 대해 알아보자.
functions of eIF1 and eIF1A
앞서 간단히 언급했던 것처럼 eIF1과 eIF1A는 ribosome 소단위체가 mRNA를 scan할 수 있도록 해줌. 일반적으로 eIF1과 eIF1A는 40S subunit과 mRNA간의 불안정한 complex 형성은 방해하고 안정적인 48S complex의 형성은 촉진시키는 역할을 하기도 함.
이 녀석들의 역할에 대해 확인하기 위해서 toeprint assay를 수행할 수 있음.
위 그림에 toeprint assay의 대략적인 과정이 나타나 있음. 이 방법에서는 기본적으로 mRNA에 붙는 primer와 함께 reverse transcriptase를 사용하게 되는데, 결과적으로 reverse transcriptase에 의해 중합이 진행되는 과정에서 40S complex에 의해 가로막히는지, 어디서 가로막히는지 여부에 따라 새로 합성되는 DNA의 길이가 달라지게 됨. 이 달라진 길이에 따라 40S subunit이 붙어있는지, 붙어있다면 어디에 붙어있는지를 알 수 있게 됨.
실험 결과를 보면 아예 40S가 없는 (a)의 경우에는 가장 긴 길이의 DNA가 합성되며 40S는 있으나 eIF1과 eIF1A는 없는 (b)의 경우에는 (a)보다는 짧은 길이의 DNA가 합성되고(5' cap을 인식해 붙은 상태에서 mRNA를 scan하지는 못하므로) 40S, eIF1, eIF1A가 다 있는 (c)의 경우에는 가장 짧은 길이의 DNA가 합성된다는 것을 알 수 있음. (이 때 elongation에 관여하는 factor들을 넣어주지 않는다면 AUG를 만난 그 시점에 40S가 멈춰있을 것임)
이와 관련된 실제 실험 결과가 위와 같음. (참고로 이 때 50-70% ammonium sulfate fraction의 의미는 50-70%의 ammonium sulfate 농도 하에서 centrifugation을 시켰을 때 분리된 단백질 fraction을 의미함. 이 fraction 안에는 eIF1A와 eIF1이 모두 들어있음)
결과를 보면 eIF1A과 eIF1이 모두 있는 lane 4, 7, 8의 경우에 가장 짧은 DNA가 합성된 것을 알 수 있음. 이를 통해 eIF1A와 eIF1이 있는 경우에만 40S의 mRNA scanning이 이루어질 수 있다는 것을 알 수 있음.
functions of eIF5 and eIF5B
eIF5와 eIF5B는 위 그림 오른쪽에 나타나 있는 것과 같이 60S subunit이 다시 join되도록 도와주는 역할을 하는 녀석임. 이 중 eIF5는 특히 eIF2에 붙어있던 GTP를 가수분해시키는 과정에 영향을 미침. (즉, eIF5가 일종의 GAP으로 작동함)
한편 eIF5B는 prokaryote에서의 IF2와 homologus를 가지고 있어서 IF2와 마찬가지로 GTP binding domain, GTPase를 가지고 있음. 이 때 GTP가 GDP로 분해되면서 결과적으로 eIF5B가 ribosomal complex로부터 차후에 release되는 것까지 똑같음. 다만 IF2와는 달리 aminoacyl-tRNA를 small ribosomal subunit으로 recruit해주는 역할을 수행하지는 않음. (이 역할을 해 주는 건 eIF2임)
이와 관련된 그림이 위에 나타나 있음. 이 때 eIF4F로 표시된 것은 eIF4G, eIF4A, eIF4B등이 합쳐져 있는 전체 eIF4를 의미함.
보면 eIF5, eIF1A, eIF4에 의해 우선 40S subunit이 43S subunit으로 변한 뒤 eIF2-GTP와 함께 들어온 tRNA와 결합함. 이후 eIF4F에 의해 mRNA가 첨가되고 eIF1도 작용해 scanning이 일어나게 되면서 결과적으로 48S complex가 만들어짐. 이후 eIF5가 작용해 eIF2에 있는 GTP를 hydrolysis시키게 되면 eIF2-GDP는 ribosome 밖으로 방출됨. 이렇게 방출된 eIF2-GDP는 다시금 eIF2B에 의해 eIF2-GTP로 바뀌게 되고, 다시금 다른 cycle에서 사용될 수 있음.
한편 이후 별도로 eIF5B-GTP가 initiation complex에 들어오고 여기 붙은 GTP가 hydrolysis 되는 과정에서 결과적으로 60S subunit이 recurit되어서 80S initiation complex가 완성되게 됨. (이 과정에서 eIF5B-GDP, Pi, eIF1, eIF1A, eIF3는 다 release됨)
다음 포스트에서는 translation initiation이 어떤 식으로 조절되는지에 대해 살펴보자.