[분자생물학] 15.1 : 5'-Cap의 구조

 

 

 

이번 포스트부터는 RNA processing의 한 종류인 5' Cap과 3' poly A tailing에 대해 알아보도록 하자.

 

 

그 중에서도 이번 포스트에서는 5' cap의 구조에 대해 중점적으로 알아보자.

 

 

1974년에, 각종 eukaryotic species와 virus로부터 분리된 mRNA들이 꽤나 많이 methylate되어있다는 것을 발견함. 이 methylation signal은 실제로 mRNA의 5' end에 있는 methylation cluster에 의해 발생한 것임.

 

 

 

cap의 구조를 알기 위해 수행한 초기 연구는 주로 쉽게 분리하고 조사할 수 있는 viral mRNA를 대상으로 진행됨.

 

 

 

 

우선 이 때 AdoMet을 사용한 실험결과와 AdoMet을 사용하지 않은 실험결과를 비교하게 되는데, AdoMet은 어떤 역할을 하는 녀석일까. AdoMet은 위 그림 왼쪽 아래와 같이 생겼으며 이 녀석에 달려있는 methyl기가 다른 곳으로 쉽게 전이되기 때문에 AdoMet은 대표적인 methylation substrate임.

 

 

 

실험 진행 과정에서 methylation을 labeling하기위해 3H를 사용하였고, nucleotide를 labeling하기 위해 gamma-32P GTP를 사용해줌. 그리고 base hydrolysis를 시켜줬는데, base hydrolysis를 해주게 되면 base가 하나씩 다 끊어지게 됨. 그 상태에서 DEAE-cellulose chromatography로 분리한 결과가 위 그림 오른쪽과 같음.

 

우선 AdoMet이 없는, control 결과를 먼저 보면 -4 charge의 부분에서 가장 많은 signal이 검출됨. 일반적으로 mononucleotide가 가지는 전하가 -4이므로 이 signal은 그냥 nucleotide들이 하나하나씩 끊어져서 생겼다고 생각하면 됨.

 

다음으로 AdoMet이 있었을 때의 결과를 보면 -4 못지않게 -5에서 많은 signal이 검출됨. 한편 methylation이 어디에 일어나 있는지를 봤더니(파란색) methylation도 -5인 부분에 많이 관찰됨. 이를 통해 mRNA의 어딘가에 -5가의 전하를 띄는 methylation site가 있다는 것을 알 수 있음.

 

 

 

 

위 실험은 기본적으로 앞서의 실험과 거의 동일하지만 phosphate를 cap에서 모두 제거해준 상태에서 수행한 실험임. (mono, 혹은 diphosphate를 제거해주는 효소 사용) (a)의 경우 paper electrophoresis를 수행한 결과인데, 이 때 각 물질들이 labeling되어 있으므로 위 그림 위쪽에 파란색, 빨간색 박스로 나타난 것과 같이 어느 부분에 이 녀석들이 존재하는지를 알 수 있음.

 

그런데 이 경우 m7G와 AdoMet을 구분하기 어렵겠다고 판단하였고, 그래서 (b)와 같이 다시금 paper chromatography를 수행함. 그 결과 딱 중간 부분에 분리된 것이 m7G라는 것을 알 수 있었음. (이후 이 sample 부분을 분리하여 m7G의 구조를 파악함)

 

 

 

참고로 추가적인 연구 과정에서 m7 G가 포함된 Cap 생성 시 nucleoside triphosphate 중에 \beta-phosphate까지가 CAP 부위에 남아있다는 사실도 밝혀냄. 이에 대해 뒤에서 다시 알아볼 것.

 

 

 

 

 

 

위 그림은 실제로 밝혀낸 reovirus Cap의 structure임. 보면 아래쪽 부분까지만 해도 우리가 알고 있는 것처럼 일반적으로 phophodiester bond가 형성되다가 5' 끝부분이 되면 우선 triphosphate linkage가 나타남. 한편 이 triphosphate의 맨 끝부분에 m7G가 결합함.

 

이 때 결합 방향이 일반적인 phosphodiester bond와는 반대인데, 보면 5C와 phosphate 사이가 연결되어 있음을 알 수 있음. 이런 식으로 GTP가 거꾸로 붙어있게 되면 당연히 일반적인 RNA 구조가 아니므로 mRNA에 추가적인 stability를 부여해주는 효과가 있음.

 

 

한편 앞서 실험 결과에서 -5가의 charge가 등장했는데, 이 -5가는 위 그림의 구조가 가지는 전하임. (위 그림 오른쪽에 각 부분의 전하와 전하들의 합이 나타나 있으므로 참고할 것)

 

 

 

그리고 위 그림에서 빨간색으로 표시된 site에 methylation이 일어나 있으며, 맨 아랫부분 OH에도 사실 methylation이 추가적으로 일어날 수도 있음.

 

일반적으로 맨 윗부분 GTP에만 메틸기가 붙어있는 녀석을 Cap 0, 맨 윗부분과 중간부분에 메틸기가 붙어있는 녀석을 Cap 1, 맨 윗부분과 중간부분, 맨 아랫부분(앞서 말한 OH 부분)에 다 메틸기가 붙어있는 녀석을 Cap 2라고 부름. 주로 viral RNA에서 관찰되는 것이 Cap 0이고 higher eukaryote에서 관찰되는 것이 Cap 1, Cap 2임.

 

 

 

 

 

Cap의 합성 과정은 위 그림과 같음. 보면 원래 있던 mRNA의 끝 부분 nucleotide 중 한 개의 phosphate가 떨어져나가고 beta-phosphate까지 남아있음. 이 녀석과 (m7G에 붙은) alpha-phosphate가 결합하여 결과적으로 Cap을 만들게 됨.

 

 

 

다음 포스트에서는 Cap의 기능에 대해 알아보자.