[세포생물학] 2.3 : FRET, FRAP

저번 포스트에서는 간단히 형광현미경의 원리에 대해 알아봤었는데요.

 

이번 포스트에서는 형광 현미경을 이용해서 단백질들의 동역학(protein dynamics)에 대해 연구할 수 있는 방법에 대해 알아볼게요.

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1. FRET

 

첫 번째로 알아볼 방법은 FRET(fluorescence resonance energy transfer, 혹은 Förster Resonance Energy Transfer)이에요.

 

풀네임이 길어서 거부감이 느껴지실수도 있을 것 같은데요..ㅋㅋㅋ

 

사실 저 풀네임 안에 FRET의 작동원리가 다 요약되어 있는거라서 주의깊게 볼 필요가 있어요.

 

 

FRET의 이름을 해부해 보자면,

 

fluorescence(형광)현상을 바탕으로 일어나는 resonance(공명)이 있고, 공명을 통해 에너지가 특정 분자에서 다른 분자로 이동하는(energy transfer) 

 

거라고 볼 수 있겠죠.

 

 

이 말만 들으면 이게 뭔 소리야;; 하실수도 있겠지만...

간단한 모식도와 함께 보면 무슨 말인지 좀 더 쉽게 이해할 수 있을 것 같아요.

 

출처 : Chen, T., He, B., Tao, J., He, Y., Deng, H., Wang, X., & Zheng, Y. (2019). Application of Förster resonance energy transfer (FRET) technique to elucidate intracellular and in vivo biofate of nanomedicines.  Advanced Drug Delivery Reviews ,  143 , 177-205.

 

위 이미지에서 donor, acceptor라고 표현되어 있는 녀석이 각각 형광물질인데요.

 

이전 포스트에서 형광물질의 특징에 대해 배웠던 것을 기억하시나요?

 

 

형광물질은 특정 파장대의 빛을 받아들이고, 그 결과 특정 파장대의 빛을 방출하는 녀석이라고 했었죠?

 

 

마찬가지로 donor와 acceptor도 이런 성질을 가지고 있는데요.

 

 

그런데 이 때 donor가 방출하는 빛의 파장과 acceptor가 흡수하는 빛의 파장이 일치하도록 잘 setting된 donor와 acceptor를 사용한다면, 앞서 말했던 energy transfer가 일어날 수 있어요. (위 그림에서 spectral overlap된 곳이 바로 이를 나타내주고 있어요)

 

 

자.. 그러면...

 

만약에 우리가 외부에서 donor가 흡수 가능한 빛을 넣어줬다!

했을때 donor는 흡수한 빛을 바탕으로 특정 파장대의 빛을 방출하겠죠?

이 때...

 

 

donor와 acceptor간의 거리가 충분히 가까워서 donor가 방출한 빛을 acceptor가 받아들일 수 있다면!

외부에서는 결과적으로 acceptor가 방출한 형광빛이 관찰되겠죠?

 

 

그런데 만약 donor와 acceptor 간의 거리가 너무 멀어서 donor가 방출한 빛을 acceptor가 받아들일 수 없다면!

외부에서는 결과적으로 그냥 donor가 방출한 형광빛이 관찰되겠죠?

 

 

 

따라서 우리는 그냥 donor, acceptor, donor가 흡수할 수 있는 파장대의 빛만 넣어주고

외부에서 어떤 파장대의 빛이 관찰되는지를 형광현미경으로 보기만 하면

특정 위치에서 donor와 acceptor간의 거리를 알 수 있어요.

 

 

 

아니 근데.... donor와 acceptor 간의 거리를 알아서 도대체 어디 써먹냐고요....

 

라는 생각이 드시겠죠? ㅋㅋㅋ

 

 

요 기술을 기가 막히게 써먹는 방법이 있는데...

바로!

 

저번 포스트에서 언급했던 GFP tagging 기술을 응용하면! 서로 다른 두 단백질간의 거리를 측정할 수 있어요!

 

2020/12/26 - [전공자를 위한 생물학/세포생물학] - [세포생물학] 2.2 : 형광현미경(fluorescence microscope), 공초점현미경(confocal microscopy), 다광자 현미경(multiphoton microscopy)

[세포생물학] 2.2 : 형광현미경(fluorescence microscope), 공초점현미경(confocal microscopy), 다광자 현미경(m

 

저번 포스트의 내용이 기억나지 않는다면 위 포스트를 참고해주시면 될 것 같고요.

 

 

GFP tagging 기술을 이용하면 결과적으로 단백질 끝부분에 형광단백질 tag를 달 수 있어요.

 

그러면 구체적으로 이 기술과 FRET을 어떻게 연결하느냐!

 

 

우리가 세포 내에서 가까이 있는지 멀리 있는지 알고자 하는 단백질 A, B가 있다고 생각해보죠.

 

이 때 GFP tagging 기술을 이용해 단백질 A에는 donor 역할을 할 수 있는 형광단백질을,

단백질 B에는 acceptor 역할을 할 수 있는 형광단백질을 붙여주고...

 

외부에서 donor가 흡수할 수 있는 파장의 빛을 쏴준다면?

 

 

결국 형광 현미경으로 색깔을 관찰할 수 있겠죠?

그리고 그 색깔을 이용하면 단백질 A와 B 사이의 거리가 가까운지 먼지에 대해 정량적으로 파악할 수 있어요.

 

 

보통은 두 단백질이 서로 가깝다! 하면 둘이 결합한다고 보기는 하는데요.

 

출처 : Glasco, D. M. (2016). Beyond the DNA-protein paradox: a “clutch” of other chicken-egg paradoxes in cell and molecular biology.  Answers Research Journal ,  9 , 209-227.

 

그렇지만 위 그림에서 초록색과 파란색 단백질처럼 서로 결국 결합해있기는 하지만, 사이에 mediator를 두고 있는 경우에는 FRET에 의한 신호가 나타나지 않겠죠?

 

그래서 FRET 신호가 나타나지 않았다고 해서 무조건 두 단백질이 결합하지 않았네! 하고 결론을 내릴 수는 없어요.

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2. FRAP

 

다음으로 알아볼 기술은 바로 FRAP(fluorescence recovery after photobleaching)인데요.

 

 

이름을 간단히 해부해보자면

 

photobleaching(광표백) 이후에 fluorescence recovery(형광 회복)을 관찰한다?

 

 

이건 또 뭔소리야 싶으시겠지만ㅋㅋ

원리를 이해하고 나면 이것만큼 잘 지은 이름도 없다고 생각하실 거예요 ㅋㅋㅋㅋ

 

출처 : Carman, C. V. (2011). Overview: imaging in the study of integrins. In  Integrin and Cell Adhesion Molecules  (pp. 159-189). Humana Press, Totowa, NJ.

 

위 그림에 FRAP의 간단한 모식도가 나타나 있어요.

 

 

FRAP의 가장 첫 단계는 우리가 유동성 여부를 관찰하고자 하는 대상(단백질이 될 수도 있고 막지질이 될 수도 있겠죠)에 형광 표지를 달아주는 거예요.

 

 

그 다음 step은 형광표지가 달린 녀석들이 존재하는 공간 중 아주 좁은, 특정한 공간에 엄청나게 강한 빛을 쏴줘서 photobleaching(광표백)을 시켜주는 거예요.

이 때 광표백을 시켜주면, 우리가 빨래할 때 얼룩이 싹 사라지는 것과 마찬가지로 형광도 싹 사라져버려요.

(위 그림에서 흰색 원으로 표시된 부분이 photobleaching된 부분이에요)

 

 

아니, 형광물질은 형광을 내라고 넣어준 거 아닌가요?

왜 강한 빛을 쏴주는데 색이 사라지는거죠?

 

물론 형광물질의 특정 파장대의 빛을 받으면 형광을 내는 건 맞아요.

그런데 이 때 말하지는 않지만 암묵적으로 깔려있는 내용이 바로 '적당한 세기의 빛을' 가해주는 거예요.

 

너무 강한 세기의 빛을 가해주게 되면, 형광물질이 속된말로 타버려요;; 아예 기능을 잃어버리는 거죠

 

 

아무튼 일단 photobleaching이 되고 나면,

 

이제 이때부터 형광현미경을 이용하여 photobleaching된 곳의 형광 intensitiy를 조사해요.

 

 

아니, 이미 색이 없어진 곳인데 왜 형광 intensity를 조사하나요?

하고 생각할 수도 있지만...

 

단백질, 혹은 막지질과 같은 생체분자들은 매우 유동적인 녀석들이기 때문에

끊임없이 이동하고 있어요.

 

 

따라서 photobleaching된 영역의 주변부에 있는 분자들이 막 이동하면서

photobleaching된 영역 안으로 들어오게 되면, 이 영역의 형광이 조금씩 회복되겠죠?

 

 

결국 시간이 오래 지나고 나면 처음에는 형광이 없었던 텅 빈 영역이

다시금 형광을 완전히 회복하게 될 거예요.

이 것이 바로 fluorescence recovery인 것이죠.

 

 

자, 그럼 fluorescence recovery 시간이 긴 물질과 짧은 물질을 비교해봤을 때

둘 중 어느 물질이 더 활발히 움직이는 녀석일까요?

 

조금만 생각해보면 recovery 시간이 더 짧을수록 활발히 움직이는 녀석이라는 것을 알 수 있겠죠?

 

 

여기서 자세히 설명하지는 않겠지만, 실제로는 FRAP 실험을 통해서 특정 물질의 diffusion coefficient(확산계수) D를 구한 다음에 물질의 평균이동속도를 계산할 수 있어요.

 

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이번 포스트에서는 FRET과 FRAP의 원리에 대해 알아봤어요.

 

정리하자면 FRET은 donor와 acceptor 간의 fluorescence resonance energy transfer 현상이 일어나는지 여부를 통해서 두 분자간의 거리를 측정하는 방법이고,

FRAP은 특정 부분을 photobleaching시킨 후 그 부분의 형광이 recovery되는 정도를 통해서 특정 분자의 이동속도를 측정하는 방법이었어요.

 

 

다음 포스트에서는 다시 현미경 part로 돌아와서, 전자현미경(electron microscopy)에 대해 알아보도록 할게요.