이번 포스트에서는 형광현미경, 공초점현미경, 다광자현미경에 대해 알아볼게요.
이들 현미경은 모두 나름의 단점들을 개선하기 위해 만들어진 것이기 때문에, 각각의 스토리도 중요하지만 서로서로가 어떻게 보완관계에 있는지를 잘 알아두시는게 더 좋을 것 같아요.
1. 형광현미경(fluorescence microscope)
앞서 살펴봤던 광학현미경들을 이용하면 관찰대상의 대략적인 모양이 어떤지,
구분되는 특정 conpartment가 있는지 정도는 알 수 있지만
구체적으로 특정 위치에 어떤 물질들이 분포하고 있는지에 대해서는 많은 정보를 얻을 수 없어요.
이러한 단점을 해소하고자 등장한 것이 바로 형광현미경(fluorescence microscope)이에요.
형광현미경을 사용하기 위해서는 당연히 시료를 형광염색해줄 수 있는 형광물질(fluorophore)이 있어야 하는데요.
가장 대표적으로 많이 사용되는 형광물질은 형광염료(fluoerscence dye)와 형광단백질(fluorescence protein)이에요.
각각에 대해 조금 더 자세히 알아보기 전에, 형광물질들이 공통적으로 가지는 특징에 대해 알 필요가 있어요.
이들은 일단 '형광'을 내는 녀석들이기 때문에 특정 파장의 빛만 흡수하고, 그 결과 특정 파장의 빛만 방출할 수 있어요.
방금 말로 설명했던 것이 위 그림에 조금 더 정확하게 표현되어 있는데요.
보어의 전자모형에 입각해서 생각해보면 결국 원자핵 주변에는 양자화된 에너지 state들이 존재하고, 이들 중 한 곳에 전자가 위치하고 있게 되죠. 그런데 이 때 원자핵 주변에 위치하는 전자가 외부 에너지를 받아 다른 에너지 state로 도약하기 위해서는 정확히 양자화된 에너지 state들 간의 에너지 차에 해당하는 에너지를 가지는 빛이 들어와야 해요. 이 때문에 특정 파장의 빛만 흡수할 수 있는 거죠.
빛의 방출과정도 마찬가지인데, 마찬가지로 높은 에너지 state로 도약한 전자가 다시 낮은 에너지 state로 떨어지면서 빛을 방출하게 될 때, 정확히 에너지 state간의 차이에 해당하는 에너지를 가지는 빛만 방출되겠죠? 이 때문에 특정 파장의 빛만 방출될 수 있어요.
이제 본격적으로 각각의 형광물질들에 대해 알아볼게요.
형광염료(fluorescence dye)는 다른 말로 화학적 형광 탐침으로도 불려요. 그 이유는 이 녀석이 화학적인 공정으로 생산되는 녀석이기 때문이죠.
엄청나게 많은 형광염료들이 있는데, 대부분 자연계에서 발생하는 특정 파장대의 빛을 내도록 가공된 녀석들이에요.
아무런 빛을 내도록 만들지 않고 굳이 '자연계에서 발생하는 특정 파장대의 빛'을 내게 만든 이유는...
뒤에서 형광현미경의 구조에 대해 살펴볼 때 다시 등장하겠지만 형광 현미경에는 '형광 필터'라는 녀석이 필요해요.
이름 그대로 특정 파장대의 형광 빛만 투과시켜주는 필터죠.
일반적으로 자연계에서 관찰되는 색상에 해당하는 필터는 아주 많이 만들어져 있는 편이에요.
그런데 뜬금없이 이상한 색을 내는 형광염료를 만들어버리면, 얘를 위해서 새로운 필터를 만들어야 되겠죠? ㅋㅋㅋㅋ
그러면 돈도, 시간도 손해보게 되겠죠...
이런 이유 때문에... 이미 자연계에서 많이 발견되어서, 이미 만들어진 필터로 다 처리 가능한 색의 형광염료가 많이 사용되고 있어요.
다음으로 형광단백질(fluorescence protein)에 대해 알아볼게요.
아마 일반생물학 수준에서 형광단백질의 대표적인 예인 GFP(green fluorescent protein)라는 녀석을 들어보셨을 것 같은데요.
GFP는 위 그림과 같이 생겼어요.
이 녀석이 처음 발견된 곳은 해파리였고, Osamu Shimomura 교수님께서 발견하셨죠.
이 녀석은 초록색을 띄는데요. 뭔가 초록색을 띄는 단백질만 가지고 있으려니 조금 아쉬운 감이 있죠?
그래서 과학자들은 GFP protein을 encoding하는 유전자(gene)에 돌연변이를 유발하여 각종 GFP derivative를 만들어내요.
그렇게 해서 위와 같이 아주 다양한 색을 내는 형광단백질들을 생산할 수 있었어요.
이런 형광단백질들은 간단히 돌연변이만 유발하면 색을 바꿀 수 있고, 이들을 생체 내에서 발현시키는 것도 가능하므로 형광염료보다 사용이 편한 측면이 있어요.
특히나 GFP를 이용하면 위 그림에 나와있는 것과 같이 특정 단백질을 GFP tagging할 수 있어요.
간단히 설명하자면, 우리가 특정 단백질을 세포 내에서 추척하고 싶다! 할때
그 단백질을 encoding하는 유전자(gene) 바로 앞에 GFP gene을 삽입시켜놓는거죠.
그러면 이 유전자가 발현될 시 단백질 앞에 GFP가 달려 있는 모양이 되겠죠?
결과적으로 이런 방법으로 단백질에 GFP 꼬리표를 달고 추적할 수 있어요.
자, 지금까지 시료를 형광표지할 수 있는 형광물질들에 대해 알아봤으니 이제 형광현미경의 구조에 대해 알아보도록 할게요.
위 그림은 형광현미경의 모식도인데요.
형광현미경에서 가장 특징적으로 쓰이는 것은 바로 두 종류의 필터(filter)에요.
위 그림을 보시면 excitation filter와 emission filter가 보이시죠?
이 중에서 excitation filter는 시료가 흡수 가능한 파장의 빛만을 걸러주는 필터이고, emission filter는 시료가 방출 가능한 파장의 빛만을 걸러주는 필터예요.
이런 filter를 통해서 결과적으로 우리가 진짜 보고자 하는 형광만을 선택적으로 관찰할 수 있게 되는 것이죠.
그 결과 위와 같은 아주 아름다운 이미지를 얻을 수 있어요.
2. 공초점 현미경(confocal microscopy)
그런데 방금 전에 살펴본 형광현미경에도 단점이 있어요.
앞서 살펴봤던 형광현미경을 wide-field fluorescence microscope라고 부르기도 하는데요.
이 녀석을 나타내주는 것이 위 그림 왼쪽 모식도예요.
보시면 시료로부터 방출된 형광이 detector에 도달하기는 하지만 너무 넓게 퍼져있는 것을 볼 수 있어요.
이런 식으로 넓게 퍼지는 현상은 형광의 성질 때문에 발생하기 때문에 기본적인 형광현미경 구조 하에서는 개선할 수 없어요.
이 문제점을 개선하고자 등장한 것이 바로 위 그림 오른쪽에 나와있는 공초점 현미경(confocal microscopy)이에요.
공초점 현미경도 형광 현미경처럼 2개의 형광필터를 사용하고, 형광 현상을 이용한다는 것은 동일한데요.
딱 한 가지 다른 점이 바로 pinhole을 사용한다는 것이에요.
이 pinhole이 바늘구멍 역할을 해서, 시료로부터 방출되는 형광 빛을 한 점으로 모아주는 효과를 내게 되고,
그 결과 빛을 더욱 더 예리하게 골라낼 수 있어요.
결과적으로 공초점 현미경은 일반적인 wide-field 형광현미경에 비해서 초점이 잘 맞고 해상도가 높다는 장점이 있어요.
3. 다광자 현미경(multi-photon confocal microscopy)
그런데 공초점 현미경에도 또 단점이 있어요...
(모든 기술에는 어쩔 수 없이 장단점이 공존하죠ㅜㅜ)
pinhole을 이용해서 방출형광을 모아주면 초점은 잘 맞고 해상도도 높겠지만,
한 점으로 형광이 모이다 보니 에너지가 너무 센 결과 시료가 손상되어버릴 수 있어요.
(한 1분정도 노출은 괜찮을지 몰라도 2~3분 정도가 지나면 시료가 타버릴 수 있어요)
이런 단점을 해결하고자 개발된 것이 바로 다광자 현미경이에요.
위 그림의 왼쪽은 일반 공초점 현미경을, 위 그림의 오른쪽은 다광자 현미경을 나타내주고 있는데요.
공초점 현미경과는 달리 다광자 현미경에서는 낮은 에너지를 가진 빛을 여러번 쏴주는 방식을 사용해요.
대신 여러 번 쏴준 빛의 에너지 총합이 공초점 현미경에서 쏴준 한 번의 빛과 같은 효과를 내서 결국에는 형광이 방출될 수 있는거죠.
그러면 결국 최종적으로 나오는 형광은 똑같은데, 다광자 현미경에서는 낮은 에너지의 빛만 사용해줬기 때문에 시료를 태울 위험이 훨씬 더 적어요.
그리고 다광자 현미경은 낮은 에너지의 빛, 즉 긴 파장의 빛을 사용하기 때문에 시료의 더 깊은 곳까지 투과할 수 있어요. (일반적으로 파장이 긴 빛일수록 투과 깊이가 더 깊어지는 성질이 있어요)
이런 좋은 투과능을 잘 이용하면 피부를 투과한 채로 이미지를 얻는 것도 가능한데요. 이를 in vivo imaging이라고 불러요.
다시말해 위 그림에 나와있는 것처럼 살아있는 생명체의 피부에 다광자 현미경을 가져다 대고 관찰할 시 피하에 존재하는 혈관, 근육 등을 관찰하는 것이 가능한 것이죠.
다만 제대로 혈관, 근육을 관찰할 수 있을 정도로 파장이 긴 빛을 사용하면 빛이 거의 적외선 영역에 해당해서 위 그림 c와 같이 거의 무색의 이미지를 얻을 수 밖에 없고, 이 때문에 형광 표지를 제대로 못 한다는 단점도 존재하기는 해요.
이번 포스트에서는 형광현미경, 공초점 현미경, 다광자현미경에 대해 알아봤어요.
이들 세 현미경은 서로 매우 밀접하게 관련되어 있기 때문에 각각의 장단점을 잘 기억해두시면 좋을 것 같아요.
다음 포스트에서는 '형광'에 대한 이야기가 나온 김에
형광을 이용해서 단백질의 dynamics를 관찰할 수 있는 FRET, FRAP 등의 방법에 대해 알아보도록 할게요.
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