[형광이미징] 3편 : 멀티컬러 이미징을 위한 형광 단백질 조합 전략
멀티컬러 형광 이미징을 하려면 단순히 색이 다른 형광 단백질을 고르는 것만으론 부족해요.
스펙트럼이 겹치면 신호가 번지고, 원하는 정보를 명확하게 얻기 어려워질 수 있거든요. 이번 글에서는 형광 단백질 조합 시 꼭 고려해야 할 3가지 핵심 포인트를 알려드릴게요.
1. 스펙트럼 중첩 피하기: 발광 및 흡수 스펙트럼을 반드시 확인하세요
형광 단백질은 각각 특정 파장의 빛을 흡수하고 또 다른 파장의 빛을 방출하죠. 그런데 여러 형광 단백질을 한 세포에 발현시키면, 서로의 방출(emission) 스펙트럼이 겹치면서 신호가 섞이는 현상이 생길 수 있어요.
예를 들어
EGFP와 YFP는 발광 파장이 너무 가까워서, 서로의 신호가 구분되지 않을 수 있어요.
반면 mTagBFP(파랑), mNeonGreen(초록), mCherry(빨강)은 서로 발광 영역이 충분히 떨어져 있어서 함께 사용하기 좋아요.
팁: 형광 단백질 선택 전에는 emission 스펙트럼 그래프를 꼭 확인하세요. 그리고 사용 중인 형광 필터와도 잘 맞는지 점검해야 해요.
2. FRET 간섭 회피하기: 불필요한 에너지 전달 막기
형광 단백질 간의 간섭은 단순히 발광 파장 겹침뿐 아니라, FRET(Förster Resonance Energy Transfer) 현상으로도 발생할 수 있어요.
FRET은 한 형광 단백질의 방출 에너지가 다른 단백질의 흡수 파장에 들어맞을 때 일어나는데, 이 경우 실제로는 형광 신호가 이동해 버려서 해석에 혼란이 생겨요.
한 예로 CFP → YFP 조합은 의도하지 않은 FRET이 발생하기 쉬워요.
만약 FRET 실험을 할 게 아니라면, 형광 단백질 간 FRET 효율이 낮은 조합을 선택하는 게 중요해요.
팁 선택하려는 단백질들의 흡수/발광 파장이 겹치는지 확인하고, FRET 위험이 있는 조합은 피해주세요.
3. 최적 조합 전략: 색상 + 성능 + 장비 호환성까지 고려하기
멀티컬러 실험을 설계할 땐 아래 요소들을 함께 고려하는 것이 좋아요.
① 색상 간 거리 확보
가능한 한 파장이 많이 떨어진 단백질을 조합해요.
예) mTagBFP (402nm) + EGFP (509nm) + mCherry (610nm)
② 밝기와 광안정성 비교
모든 단백질이 동일하게 밝지 않기 때문에, 상대적으로 신호가 약한 단백질에 더 많은 발현량을 배분하거나, 강한 프로모터를 붙이는 식으로 보완해요.
③ 현미경 필터 확인
내가 사용하는 형광 현미경에 장착된 필터 세트가 어떤 파장을 지원하는지도 반드시 확인해야 해요. 필터 범위에 맞지 않는 형광 단백질은 아무리 좋은 특성을 가지고 있어도 실제 관찰이 어렵죠.
2색 조합 예시: mNeonGreen + mScarlet
3색 조합 예시: mTagBFP + mNeonGreen + mCherry
4색 조합 예시 (고급): mTagBFP + mClover3 + mKOκ + mCardinal
이렇게 성능과 스펙트럼을 함께 고려하면, 훨씬 더 정확하고 안정적인 멀티컬러 형광 이미지를 얻을 수 있어요.