[AAV] 7편 : AAV ITR 완전 정복 – 작지만 핵심적인 DNA 구조
AAV 실험을 시작하면 가장 먼저 듣게 되는 말 중 하나가 “ITR 잘 보존됐나 확인했어?”라는 말이에요.
그만큼 ITR(Inverted Terminal Repeat)은 AAV의 생존과 성공을 좌우하는 아주 중요한 요소예요. 작고 짧지만, AAV 벡터 안에서 복제, 포장, 발현 안정성에 직접적으로 관여하거든요.
ITR이란 무엇인가요?
ITR은 AAV의 양 끝에 존재하는 145bp의 반복 서열로, 구조적으로는 T자형의 스템-루프 구조를 형성해요. 이 구조 덕분에 복제의 시작점이 되며, AAV 벡터가 세포 내에서 안정적으로 머무를 수 있도록 도와줘요.
ITR은 실험실에서 사용하는 AAV 벡터에서는 유일하게 보존되는 바이러스 유전 정보예요. AAV를 생산할 때 사용하는 transfer plasmid에서 실제로 포장되는 유전자는 ITR 사이에 있는 부분이고, 그 외의 나머지 부분은 포장되지 않아요.
ITR의 주요 기능 3가지
복제의 시작점 역할
ITR은 Rep 단백질이 결합할 수 있는 RBE(Rep binding element)와 TRS(terminal resolution site)를 포함하고 있어서, 바이러스 DNA가 복제될 때 출발점이 돼요.
포장 시그널 제공
AAV의 유전체는 RepCap 단백질에 의해 포장되는데, ITR이 있어야만 바이러스 캡시드에 유전자가 들어갈 수 있어요.
유전자 발현의 지속성 유지
ITR은 유전체가 세포 내에서 episome(엽서처럼 따로 떠다니는 DNA)으로 남을 수 있게 도와줘서, 장기적인 발현을 가능하게 해요.
flip과 flop 구조?
ITR은 palindromic(회문형) 구조이기 때문에, 방향성이 뒤바뀐 두 가지 형태 – flip과 flop – 로 존재할 수 있어요. 실험적으로는 두 형태 모두 기능적으로 문제는 없지만, 구조 예측이나 재조합 빈도에는 영향을 줄 수 있어요. ITR을 연구하는 사람들은 이 차이를 정밀하게 분석하기도 해요.
실험에서 주의할 점 – ITR, 잘 지키는 법
ITR은 구조적으로 불안정해서, 플라스미드 증폭 중에 손상되기 쉽고, 심하면 삭제되기도 해요. 그러면 바이러스가 포장되지 않아서, 실험 전체가 무의미해질 수 있죠.
✔ 1. Stbl3, NEB Stable 같은 recombination-deficient 균주를 사용하세요.
✔ 2. 30도에서 저속 배양을 추천해요. 37도보다 안정성이 좋아요.
✔ 3. SmaI나 XmaI로 제한효소 처리 후 gel electrophoresis로 intact 여부를 확인하세요.
✔ 4. Sanger 시퀀싱은 실패할 확률이 높아요. 대신 NGS 또는 restriction digest가 더 안정적이에요.
최근 연구에서의 응용
최근에는 ITR 내부를 변형해서 전사인자 결합 부위를 넣거나, 다른 serotype의 ITR을 조합해 효율을 조절하는 연구도 활발히 진행되고 있어요. AAV2 ITR이 가장 많이 사용되지만, 다양한 변형이 새로운 기능을 부여하고 있어요.
작고 단순해 보이지만, ITR은 AAV의 핵심 기능을 통제하는 매우 똑똑한 구조예요.
앞으로 AAV 실험을 할 때, ITR의 역할과 중요성을 꼭 기억해두세요.
다음 편에서는 ITR이 실제로 AAV 생산과 실험에서 어떤 영향을 미치는지, 그리고 문제가 생겼을 때 어떻게 해결할 수 있는지 사례 중심으로 더 깊이 있게 다뤄볼게요.