[AAV] 4편 : AAV 정제와 타이트레이션 – 깨끗하고 정확하게 준비하는 법
AAV를 생산하고 나면 그다음 단계는 바로 정제와 타이트레이션이에요. AAV는 배양액이나 세포 안에서 복잡한 성분들과 섞여 만들어지기 때문에, 이걸 깨끗하게 분리하고, 얼마나 들어 있는지 정확히 측정해야 실험에서 원하는 결과를 얻을 수 있어요.
AAV 정제 – PEG 침전과 iodixanol 그라디언트
AAV를 정제하는 첫 번째 방법은 바로 PEG 침전법이에요. 보통 40% PEG 용액을 배양액에 넣어 최종 농도를 8%로 맞춘 뒤 냉장 보관해요.
이 과정을 거치면 바이러스 입자들이 뭉쳐서 가라앉고, 이를 원심분리로 수확할 수 있어요. 이 방법은 간단하고 대량으로 처리할 수 있지만, 완전히 깨끗한 정제는 어렵다는 단점이 있어요.
좀 더 정밀하게 정제하고 싶을 때는 iodixanol 그라디언트 원심분리법을 사용해요. 이건 15%, 25%, 40%, 60%의 iodixanol 층을 시험관에 차곡차곡 쌓은 다음, 그 위에 바이러스 용액을 올리고 초고속 원심분리를 하는 방식이에요. AAV는 보통 40% 구간에 모이기 때문에, 이 층만 조심스럽게 빼내서 버퍼 교환과 농축을 해주면 돼요.
iodixanol 정제는 시간이 조금 걸리긴 하지만, 불순물 없이 아주 고순도의 AAV를 얻을 수 있는 방법이에요. 연구에 따라 PEG 침전과 병행하거나 단독으로 사용해요.
AAV 타이트레이션 – 역가(titer) 측정하는 방법
AAV를 깨끗하게 정제한 뒤에는, 도대체 얼마나 만들어졌는지 확인해야 해요. 이걸 타이트레이션(titration)이라고 하죠. 여러 가지 방법이 있지만, 실험실에서 가장 많이 쓰이는 건 qPCR을 이용한 물리적 역가 측정법이에요.
qPCR을 이용하면 캡시드 안에 실제 유전자가 들어 있는 바이러스 입자의 수를 측정할 수 있어요. 이때는 보통 transgene이나 ITR을 타겟으로 하는 프라이머를 사용해요. 중요한 건, qPCR을 하기 전에 DNase 처리를 꼭 해줘야 해요. 그래야 플라스미드나 잔여 DNA가 제거되고, 오직 진짜 바이러스에 들어 있는 유전자만 측정할 수 있거든요.
조금 더 정밀한 방법으로는 ddPCR(droplet digital PCR)도 있어요. 이건 정확도가 높지만 장비가 조금 더 고급이고, 시간이 오래 걸릴 수 있어요.
반대로, 바이러스가 실제로 감염이 가능한지를 알고 싶다면 TCID50 같은 감염 기반 역가 측정법을 써요. 이 방법은 감염력까지 확인할 수 있어서 생체 실험에 유용하지만, 시간도 오래 걸리고 조건이 까다로워요.
한편, ELISA 기반 측정법도 있지만, 이건 유전자 없이 빈 캡시드까지 포함해서 측정되기 때문에 정확한 감염성 바이러스 입자 수를 알기 어렵다는 단점이 있어요.
실험을 위한 팁
qPCR은 가장 널리 쓰이고 실험실에서도 쉽게 접근 가능해요.
정제한 AAV는 -80°C에서 냉동 보관하면 안정적으로 오래 쓸 수 있어요.
타이트레이션할 땐 항상 샘플 희석 배수와 DNase 처리 여부를 꼼꼼히 기록하세요.
실험마다 MOI(감염 배수) 최적화를 새로 해야 해요. 배치마다 차이가 있거든요.
이렇게 해서 AAV 정제와 타이트레이션까지의 전 과정을 마쳤어요!
다음 편에서는 이 AAV를 실제 실험에서 어떻게 응용하는지, 예를 들어 유전자 전달, CRISPR, 신경과학, 유전자 치료 등 다양한 분야에서의 활용 예시를 소개해드릴게요.